在組織實(shí)驗中，石蠟切片和冰凍切片是最常見(jiàn)的兩種切片方法，兩種優(yōu)缺點(diǎn)明顯，在實(shí)驗的應用上也大有不同。而兩個(gè)實(shí)驗的相同點(diǎn)都是應用免疫學(xué)基本原理——即抗原與抗體特異性結合的原理，通過(guò)化學(xué)反應使標記抗體的顯色劑顯色來(lái)確定組織細胞內蛋白質(zhì)，對其進(jìn)行定位、定性及相對定量的研究。

有些做實(shí)驗的小伙伴們，對于石蠟切片和冰凍切片處于傻傻分不清楚，今天我們就來(lái)介紹一下兩者的實(shí)驗步驟和不同點(diǎn)。

石蠟切片

組織學(xué)常規制片技術(shù)中最為廣泛應用的方法。石蠟切片不僅用于觀(guān)察正常細胞組織的形態(tài)結構，也是病理學(xué)和法醫學(xué)等學(xué)科用以研究、觀(guān)察及判斷細胞組織的形態(tài)變化的主要方法，而且也已相當廣泛地用于其他許多學(xué)科領(lǐng)域的研究中。

1、固定：將新鮮組織切成小塊，固定于4%多聚甲醛過(guò)夜。凝固組織中的物質(zhì)成分，盡可能保持其活體時(shí)的結構。同時(shí)能使組織硬化，有利于切片的進(jìn)行。

2、脫水：為了減少組織材料的急劇收縮，應使用從低濃度到高濃度遞增的順序進(jìn)行經(jīng)70%、85%、95%直至純酒精（無(wú)水乙醇），每次時(shí)間為1小時(shí)。固定后的組織材料需除去留在組織內的固定液及其結晶沉淀，否則會(huì )影響后期的染色效果。

3、透明：常用的透明劑有二甲苯，二甲苯是石蠟的溶劑。純酒精不能與石蠟相溶，還需用能與酒精和石蠟相溶的溶劑，替換出組織內的酒精。材料塊在透明劑浸漬過(guò)程稱(chēng)透明。

4、浸蠟：先把組織材料塊放在熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液浸漬1小時(shí)。先后移入2個(gè)熔化的石蠟液中浸漬1小時(shí)左右。

5、包埋：以少許熱蠟液將其底部迅速貼附于包埋盒內上，然后置于速凍臺，讓石蠟固定。

6、切片：切片刀的銳利與否、蠟塊硬度是否適當都直接影響切片質(zhì)量，可將蠟塊至于冷水中改變蠟塊硬度。通常切片厚度為3-5um，用毛筆輕托輕放在37度水浴中展片。

7、貼片與烤片：一般使用恒溫水浴鍋，溫度控制在37-40℃左右，有利于石蠟切片的展開(kāi)，貼好的切片置于60℃恒溫箱內干燥2小時(shí)，蛋白質(zhì)凝固后即可染色。

8、切片脫蠟及水化：干燥后的切片置于二甲苯中進(jìn)行脫蠟，然后依次使用從高濃度到低濃度遞減的順序進(jìn)行經(jīng)純酒精、95%、85%、70%進(jìn)行水化。

9、染色：

經(jīng)典的蘇木精和伊紅：細胞核被蘇木精染成紫藍色，多數細胞質(zhì)及非細胞成分被伊紅染成粉紅色。實(shí)驗操作簡(jiǎn)單。

免疫組化：指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過(guò)抗原抗體反應和組織化學(xué)的呈色反應。

（圖為HE染色，此圖為公司實(shí)驗圖，盜圖必究 ）

冰凍切片

冰凍切片是一種在低溫條件下使組織快速冷凍到一定的硬度，然后進(jìn)行切片的一種方法。制作過(guò)程較石蠟切片快捷、簡(jiǎn)便，因而多應用于手術(shù)中的快速病理診斷。

一、取材：

應盡可能快地采取新鮮的材料，防止組織發(fā)生死后變化。

二、速凍：

1、將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內（直徑約2cm）。

2、如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒(méi)組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內。 

3、當盒底部接觸液氮時(shí)即開(kāi)始氣化沸騰，此時(shí)小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結成塊。

4、在制成凍塊后，即可置入恒冷箱切片機冰凍切片。

5、若需要保存，應快速以鋁箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱貯存備用。

三、固定：

1、樣品托上涂一層OCT包埋膠，將速凍組織置于其上，4℃冰箱預冷5-10min讓OCT膠浸透組織。

2、取下組織置于錫箔或者玻片上，樣品托速凍。

3、組織置于樣品托上，其上再添一層OCT膠，以完全覆蓋為宜，速凍架（PE）上30min。

四、切片：

1、恒溫冰凍切片機為較理想的冰凍切片機，其基本結構是將切片機置于低溫密閉室內，故切片時(shí)不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續切薄片至5-10μm。

2、切片時(shí)，低溫室內溫度以-15℃ ~ -20℃為宜，溫度過(guò)低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動(dòng)。

五、免疫熒光染色：

1、冰凍切片室溫晾干15min，可用含10%正常山羊血清的PBS室溫封閉切片1小時(shí)（此步可不洗）。 

2、滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液（抗體的量視組織大小而定，原則是可以均勻覆蓋組織面，且保證整個(gè)過(guò)程中不會(huì )使組織干涸）。

3、將切片放在加了PBS的免疫組化濕盒，室溫孵育2小時(shí)或4℃過(guò)夜。

4、第二天先將濕盒放到37℃回溫1h，然后吸取片上的一抗進(jìn)行回收，將切片插入到小染缸PBS沖洗。

5、滴加用PBS稀釋好的二抗（避光）置于分子雜交箱中37℃孵育1小時(shí)?；厥斩?，切片置于染缸內，PBS洗5min×3次。

6、滴加DAPI工作液染核，室溫10-20min（工作濃度0.1%染色15min）。

7、回收DAPI，滴加5-10μl抗熒光衰減封片劑或中性樹(shù)膠，用處理干凈的蓋玻片封片，即可到熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下觀(guān)察拍照。

8、做好的切片放在切片盒內，置于4℃冰箱，可保存一周左右。

（圖為免疫組化，此圖為公司實(shí)驗圖，盜圖必究 ）

優(yōu)缺點(diǎn)的不同

	石蠟切片	冷凍切片
應用對象	廣泛應用常規制片	手術(shù)中的快速病理診斷
保持時(shí)間	持久保存	保存時(shí)間較短
優(yōu)點(diǎn)	1、 細胞定位準確 2、 組織細胞形態(tài)結構保存完好， 3、 保存時(shí)可放在室溫下保存	1、 簡(jiǎn)便。 2、 快速，用時(shí)短 3、 組織變化不大 4、 能很好的保存脂肪、類(lèi)脂等成分 5、 較好的保存抗原活性及酶類(lèi)。
缺點(diǎn)	1、步驟繁多，制片中抗原活性有所降低	1、不易做連續切片 2、切取的組織不能過(guò)大