DCFH-DA本身沒(méi)有熒光，可以自由穿過(guò)細胞膜，進(jìn)入細胞內后，可以被細胞內的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內。細胞內的活性氧可以氧化無(wú)熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光就可以知道細胞內活性氧的水平。

一、實(shí)驗材料及試劑

培養板、酒精燈、移液槍、CO2培養箱、流式細胞儀、熒光顯微鏡等；DCFH-DA、PBS、HREC、20,70-二氯二熒光素二乙酸鹽（H2DCFDA; Molecular Probes）、MFL等。

二、實(shí)驗內容

細胞內ROS檢測：按照1:1000用無(wú)血清培養液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。去除四組細胞培養液，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分覆蓋住細胞為宜，通常對于六孔板的一個(gè)孔加入稀釋好的DCFH-DA不少于1ml，37℃細胞培養箱內孵育20min，用無(wú)血清的培養液洗滌細胞三次，以充分去除未進(jìn)入細胞的，使用激發(fā)488nm波長(cháng)，525nm發(fā)射波長(cháng)，用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測。

細胞線(xiàn)粒體內檢測：去除細胞培養液，培養的細胞通過(guò)20,70-二氯二熒光素二乙酸鹽（H2DCFDA; Molecular Probes）檢測ROS產(chǎn)生和線(xiàn)粒體特異性染料（MitoFLuor Red589; MFL;分子探針）對線(xiàn)粒體染色。 MFL在線(xiàn)粒體中累積而不管線(xiàn)粒體膜電位的變化，MFL發(fā)射波長(cháng)是622nm，發(fā)射波長(cháng)為525nm，在不同時(shí)間用PBS沖洗HREC。 將H2DCFDA和MFL分別加入以終濃度為2mM和500nM加入到不含酚紅的培養基中后，將細胞在37℃下孵育45分鐘，然后用新鮮的預熱培養基洗滌兩次，并在激光掃描共焦顯微鏡（LSM 510; Zeiss，Oberkochen，德國）下觀(guān)察。 H2DCFDA的綠色熒光在488nm激發(fā)，MFL的紅色熒光在588nm激發(fā)。 使用Zeiss軟件計算每平方毫米細胞面積的平均熒光強度。

三、注意事項

1、探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進(jìn)入細胞內的探針，否則會(huì )導致背景較高。

2、探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進(jìn)行激發(fā)波長(cháng)的掃描和發(fā)射波長(cháng)的掃描，以確認探針的裝載情況是否良好。

3、盡量縮短探針裝載后到測定所用的時(shí)間（刺激時(shí)間除外），以減少各種可能的誤差。

4、為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

5、對不同的細胞和組織，應選擇合適的孵育時(shí)間和濃度，以觀(guān)察ROS的變化。