原代細胞的培養方法
發(fā)布人：admin
瀏覽次數：1461
發(fā)布時(shí)間：2016-08-24
原代細胞的培養也叫初代培養 是從供體取得組織細胞在體外進(jìn)行的首次培養，是建立細胞系的第一步，是一項基本技術(shù)。原代細胞因剛從組織中分離開(kāi)，生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍保留原來(lái)的遺傳特性，也最接近和反映體內生長(cháng)特性，適宜用于藥物敏感性試驗、細胞分化等實(shí)驗研究。
原代細胞往往有多種細胞組成，比較混雜，即使從形態(tài)上為同一類(lèi)型（上皮樣或成纖維樣），但細胞間仍有很大差異。如果供體不同，即使組織類(lèi)型、部位相同，個(gè)體差異也照樣存在，原代細胞生物特性尚不穩定，如需做較為嚴格的對比性實(shí)驗研究，還需進(jìn)行短期傳代培養。
1、組織塊培養法
組織塊培養是常用、簡(jiǎn)便易行和成功率較高的原代培養方法，也是早期采用培養細胞的方法，故原先被稱(chēng)為組織培養。其方法：為將剪成的小組織團塊接種于培養瓶（或皿）中，瓶壁可預先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著(zhù)于瓶壁，使周邊細胞能沿瓶壁向外生長(cháng)，方法簡(jiǎn)便，利于培養，部分種類(lèi)的組織細胞在小塊貼壁24小時(shí)后細胞就從組織塊四周游出，然后逐漸延伸，長(cháng)成肉眼可以觀(guān)察到的生長(cháng)暈，5~7天后組織塊中央的組織細胞逐漸壞死脫落和發(fā)生漂浮，此漂浮小塊可隨換液而棄去，由組織塊周?chē)由斓馁N壁細胞也逐漸形成層片，可在顯微鏡下觀(guān)察形態(tài)和用于實(shí)驗研究。
其培養方法如下：
(1)按照前述方法取材，將組織剪成或切成1mm3大小的小塊，并加入少許培養基使組織濕潤。
(2)將小塊均勻涂布于瓶壁，每小塊間距0.2 cm~0.5cm，一般在25mL培養瓶(底面積為17.5cm2)可接種20～30小塊為宜,小塊放置后,輕輕翻轉培養瓶,使瓶底朝上,然后于瓶?jì)燃尤脒m量培養基蓋好瓶塞,將瓶?jì)A斜放置在37℃溫箱內。
(3)培養2~4小時(shí)，待小塊貼附后，將培養瓶緩慢翻轉平放，靜置培養，動(dòng)作要輕，嚴禁搖動(dòng)和來(lái)回振蕩，以防由于沖動(dòng)而使小塊漂起而造成培養失敗，若組織塊不易貼壁可預先在瓶壁涂一薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。開(kāi)始培養時(shí)培養基不宜多，以保持組織塊濕潤即可，培養24小時(shí)后再補液，培養初期移動(dòng)和觀(guān)察時(shí)要輕拿輕放，開(kāi)始幾天盡量不去搬動(dòng)，以利貼壁和生長(cháng)，培養3~5天時(shí)可換液，一方面補充營(yíng)養，一方面去除代謝產(chǎn)物和漂浮小塊所產(chǎn)生的毒性作用。
2.消化培養法
該方法是采用前述的消化分散法，將妨礙細胞生長(cháng)的細胞間質(zhì)（包括基質(zhì)、纖維等）去除，使細胞分散形成細胞懸液，然后分瓶培養。
某些特殊類(lèi)型細胞，如內皮細胞、骨細胞等的消化手段和步驟，將在有關(guān)章節中敘述。
3.懸浮細胞培養法
對于懸浮生長(cháng)的細胞，如白血病細胞、淋巴細胞、骨髓細胞、胸水和腹水中的癌細胞和免疫細胞無(wú)需消化，可采用低速離心分離，直接培養，或經(jīng)淋巴細胞分層液分離后接種培養。
4.器官培養
器官培養是指從供體取得器官或組織塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養，其特性仍保持原有器官細胞的組織結構和聯(lián)系、并能存活，器官培養的目的和技術(shù)均與單層細胞培養不同，但可利用器官培養對器官組織的生長(cháng)變化進(jìn)行體外觀(guān)察。并觀(guān)察不同培養條件研究對器官組織的影響。器官培養可保持器官組織的相對完整性，可用于重點(diǎn)觀(guān)察細胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調節作用。體外器官培養為臨床上的器官移植創(chuàng )造了便利的條件。器官培養的條件與細胞培養不同，要有特殊的要求。
1. 器官培養的特殊的要求
(1)需要特殊的培養條件 因器官離體培養，其營(yíng)養和氧氣僅靠自然滲透來(lái)供給，因此，培養時(shí)為了確保中心不發(fā)生缺乏氧和營(yíng)養而造成壞死，其厚度或直徑不宜超過(guò)1mm。
(2)器官內部細胞需要有足夠的氧氣滲入 常采用以下兩種方法：
a. 將器官組織塊置于培養基氣液面以利于氣體交換。
b. 提高培養基中的氧分壓，一般需加注純氧，提高氧分壓時(shí)仍需保持5% CO2，以維持pH。
2. 器官培養的方法
(1)將不銹鋼網(wǎng)做成的支架，放置于培養皿中，高度為1/2皿高，使其表面鋪上0.5mm孔徑的濾膜。
(2)將培養基加入平皿中，使培養液剛剛接觸到濾膜，但不要使濾膜浮起。
