當單個(gè)細胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細胞群體，成為集落或克隆。每個(gè)克隆含有50以上的細胞，大小在0.3-1.0mm之間。集落形成率表示細胞的獨立生存能力，各種理化因素可能導致細胞的克隆形成能力發(fā)生改變。通過(guò)一定的實(shí)驗方法可以對細胞的克隆形成能力進(jìn)行檢測，細胞克隆形成率即細胞接種存活率，表示接種細胞后貼壁的細胞成活并形成克隆的數量。貼壁后的細胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆，而形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞?？寺⌒纬陕史从臣毎后w依賴(lài)性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。

（一）實(shí)驗材料及試劑

水浴鍋、超凈臺、倒置顯微鏡、酒精燈、移液槍等；Argrose、BIOWEST  REGULAR Argrose G10、雙蒸水（DDW）、血清、雙抗、吉姆薩染液、胰蛋白酶、R1640、PBS等。

（二）實(shí)驗內容

          軟瓊脂克隆形成實(shí)驗——懸浮細胞

         1、配制100ml的1.2% Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA電泳用BIOWESTREGULAR Argrose G10（4℃），溶劑用雙蒸水（DDW），高壓滅菌后，維持在42℃中不會(huì )凝固；

         2、實(shí)驗前，將水浴鍋放入超凈臺內，紫外照射，設定溫度42℃。提前融化血清和雙抗。

         3、如已制好上下膠，則在微波爐中溶解1.2% Argrose下膠和0.7% Argrose上膠，降溫后放入42℃水浴鍋中保持。

         4、根據實(shí)驗需要的量配制20% FBS+2×R1640（5種細胞配40ml），每種細胞設3 個(gè)復孔。

         5、鋪下膠：按1:1比例使1.2%Argrose下膠和20%FBS+2×R1640混合，6孔板每孔迅速加入1.5ml混合液，輕輕混勻，室溫靜置待下膠凝固（加混合液時(shí)不能產(chǎn)生氣泡）。對于一個(gè)6孔盤(pán)，配5ml上述培養液+5ml 1.2%Argrose下膠于50ml離心管中（離心管要一直置于水浴鍋中）。

         6、細胞計數：取各組對數生長(cháng)期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，作活細胞計數，用正常培養液調整細胞密度至40×10⁴／ml以上，這樣加的體積小于100ul，不會(huì )影響其他成分的稀釋程度。每孔鋪1萬(wàn)個(gè)細胞，準備4個(gè)孔的細胞數，即4×10⁴。

         7、鋪上膠：按1:1比例混合0.7% Argrose上膠和20%FBS+2×R1640，每種細胞需先配2ml（20%FBS+2×R1640）+2ml0.7% Argrose上膠于離心管中混勻，放入42℃水浴鍋中保持。再將細胞懸液加入上述混合液中，混勻后迅速加入6孔板中，每孔1ml。待上層瓊脂凝固后，置于5%CO₂，37℃，培養2-3 周。

         8、間隔2天補加200ul 10%FBS+R1640，以防過(guò)于干燥。

         9、計數克?。喊哑矫蠓胖迷诘怪蔑@微鏡下（100×），在鏡下隨機選擇10個(gè)視野，計數視野中大于50個(gè)克隆數(﹥0.05mm的克隆)和所有克隆數，克隆形成率=大于50個(gè)克隆數/所有克隆數×100%。每孔加入1ml的吉姆薩染液，20min，鏡下拍照。

   平板克隆形成實(shí)驗

         1、取對數生長(cháng)期的單層培養細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細胞，把細胞懸浮在10%胎牛血清的RPMI1640培養液中備用。

         2、將細胞懸液作梯度倍數稀釋?zhuān)赃m當的細胞密度(根據增殖能力)接種于培養皿中。一般分每皿50、100、200個(gè)細胞的梯度密度分別接種含10mL 37℃預溫培養液的皿中，并輕輕轉動(dòng)，使細胞分散均勻。置37℃，5% CO₂及飽和濕度的環(huán)境下，靜置培養2～3周。

         3、經(jīng)常觀(guān)察，當培養皿中出現肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分鐘。然后去固定液，加適量Giemsa應用染色液染10～30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

         4、將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計數大于10個(gè)細胞的克隆數。最后計算克隆形成率?？寺⌒纬陕? (克隆數/接種細胞數)×100%                

（三）注意事項

         1、平板克隆形成試驗方法簡(jiǎn)單，適用于貼壁生長(cháng)的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關(guān)鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞一定要分散得好，不能有細胞團，接種密度不能過(guò)大。

         2、瓊脂對熱和酸不穩定，若反復加熱，容易降解而產(chǎn)生毒性，且硬度下降。因此高壓滅菌后應進(jìn)行分裝；

         3、細胞在進(jìn)行克隆形成實(shí)驗時(shí)要求有95%以上的分散度，否則結果的準確度會(huì )受到很大影響；

         4、軟瓊脂與細胞混合時(shí)溫度不能超過(guò)40℃，否則將會(huì )燙傷/死細胞；

         5、接種時(shí)細胞密度適度，不可過(guò)高。

         6、細胞在低密度、非貼壁狀態(tài)條件下培養，生存率明顯下降，永生細胞系/株克隆形成率可達到10%以上，但初代培養細胞和有限傳代細胞系克隆形成率僅為0.5%-5%，甚至無(wú)法形成單個(gè)克隆。因此，為了提高克隆形成率，有時(shí)需要在培養基中添加胰島素、地塞米松等促克隆形成物質(zhì)。

         7、細胞接種存活率只表示接種細胞后貼壁的細胞數，但貼壁后的細胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞?？寺⌒纬陕史从臣毎后w依賴(lài)性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。由于細胞生物學(xué)性狀不同，細胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養細胞克隆形成率弱，傳代細胞系強；二倍體細胞克隆形成率弱，轉化細胞系強；正常細胞克隆形成率弱，腫瘤細胞強。并且克隆形成率與接種密度有一定關(guān)系，做克隆形成率測定時(shí)，接種細胞一定要分散成單細胞懸液，直接接種在碟皿中，持續一周，隨時(shí)檢查，到細胞形成克隆時(shí)終止培養。