一、原理

培養的細胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長(cháng)良好，所以要進(jìn)行細胞計數。計數結果以每毫升細胞數表示。細胞計數的原理和方法與血細胞計數相同。

在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力，由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解分離的過(guò)程對細胞是否有損傷作用。復蘇后的細胞也要檢查活力，了解凍存和復蘇的效果。

用臺盼蘭染細胞，死細胞著(zhù)色，活細胞不著(zhù)色，從而可以區分死細胞與活細胞。利用細胞內某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應，也可測定細胞相對數和相對活力。
 

二、儀器、用品與試劑

1.  儀器與用品：普通顯微鏡.  血球計數板、試管、吸管、酶標儀（或分光光度計）

2.  試劑：0.4%臺盼蘭，0.5%四甲基偶氮唑鹽（MTT）、酸化異丙醇

3.  材料：細胞懸液
 

三、操作步驟

（一）細胞計數

1.  將血球計數板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計數板上。

2.  將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿(mǎn)蓋片和計數板之間。

3.  靜置3分鐘。

4.  鏡下觀(guān)察，計算計數板四大格細胞總數，壓線(xiàn)細胞只計左側和上方的。然后按下式計算：

細胞數/ml＝4大格細胞總數/ 4×10000

注意：鏡下偶見(jiàn)由兩個(gè)以上細胞組成的細胞團，應按單個(gè)細胞計算，若細胞團占10%以上，說(shuō)明分散不好，需重新制備細胞懸液。

（二）細胞活力

1.  將細胞懸液以0.5 ml 加入試管中。

2.  加入0.5 ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2~3分鐘。

3.  吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。

4.  鏡下取幾個(gè)任意視野分別計死細胞和活細胞數，計細胞活力。

死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見(jiàn)深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無(wú)色透明狀。

活力測定可以和細胞計數合起來(lái)進(jìn)行，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。

（三）MTT法測細胞相對數和相對活力

活細胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產(chǎn)生蘭色結晶狀甲贊顆粒積于細胞內和細胞周?chē)?。其量與細胞數呈正比，也與細胞活力呈正比。

1.  細胞懸液以1000 rpm 離心10分鐘，棄上清液。

2.  沉淀加入0.5~1 ml MTT，吹打成懸液。

3.  37℃下保溫2小時(shí)。

4.  加入4~5 ml 酸化異丙醇（定容）。打勻。

5.  1000 rpm 離心，取上清液酶標儀或分光光度計570 nm 比色，酸化異丙醇調零點(diǎn)。

注意：MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數。

附：

1.  0.4%臺盼蘭染液配制：

臺盼蘭 0.4克 加雙蒸水至100 ml。

2.  MTT配制：

MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液或無(wú)酚紅的基礎液中。4℃下保存。

3.  酸化異丙醇配制：

異丙醇中加入HCl使最終達0.04 mol/L。

（本文轉載丁香通）