歷史上，帕克等人在1956年提出的克隆實(shí)驗用于評估細胞形成克隆的能力，在這種技術(shù)中，細胞被分散到培養板上，生長(cháng)在飼養細胞或含有必要生長(cháng)因子的條件培養基上。

  這種技術(shù)的局限性在于它只提供了關(guān)于克隆形成的信息。正常細胞脫離原來(lái)生存環(huán)境發(fā)生一種特定類(lèi)型的程序化死亡形式，稱(chēng)為失巢凋亡。

  然而，轉化細胞具有在不與底物結合的情況下生長(cháng)和分裂的能力。為了利用這一概念，研究人員開(kāi)發(fā)了軟瓊脂克隆形成試驗。近年來(lái)，軟瓊脂克隆形成試驗已被改進(jìn)，以滿(mǎn)足特定的需要，一種是摻入熒光染料，允許高通量菌落計數，另一種是使用專(zhuān)門(mén)的瓊脂溶液，以便在需要蛋白質(zhì)或DNA樣本進(jìn)行克隆形成后檢索活細胞。  

圖 腫瘤細胞軟克隆實(shí)驗結果

  在傳統的軟瓊脂克隆形成試驗中，細胞生長(cháng)在上層含有細胞培養基的軟瓊脂中，下層軟瓊脂也與細胞培養基混合，但含有較高濃度的瓊脂。這可以防止細胞貼附在培養板上，還可以使轉化細胞形成可見(jiàn)的菌落。這種技術(shù)的原理是正常細胞依靠細胞與細胞外基質(zhì)的接觸才能生長(cháng)和分裂，相反，不管周?chē)h(huán)境如何，轉化細胞均具有生長(cháng)和分化的能力，因此能夠以錨定獨立的方式形成菌落的細胞被認為是轉化和致癌的。這種方法的總體目標是以半定量和嚴格的方式測定細胞的這種能力。

       準備材料和試劑：

       1、配制2×培養基：1 g培養基粉末，0.2 g碳酸氫鈉，加入去離子水，定容到50 mL。

       2、將培養基經(jīng)0.2 μm濾膜過(guò)濾除菌。

       3、加入目標細胞所需培養基的其他成分。例如：用RPMI 1640培養基培養CMT 167細胞需要加入10% FBS，1% 青霉素/鏈霉素。使用之前將培養基放在37°C水浴。

       4、配制1×培養基，依照目標細胞生長(cháng)所需培養基配制。

       5、配制1%瓊脂：1 g瓊脂加入到100 mL去離子水中。

       6、配制0.6%瓊脂：0.6 g瓊脂加入到100 mL去離子水中。

       7、將配好的瓊脂經(jīng)高溫高壓滅菌，滅菌后可放在4°C保存，使用前加熱至完全溶解。

       8、配制氯化硝基四氮唑藍溶液：1 mg/mL氯化硝基四氮唑藍加入到1×PBS中。

鋪下膠：

       1、將熔化的1%瓊脂溶液和預熱的2×培養基放入裝滿(mǎn)熱水（42°C）的桶（或水浴鍋）中，在熱水里放一個(gè)50 mL的錐形管。將桶放入超凈臺內。

       2、6孔板中的每個(gè)孔需要加入1.5 mL混合的瓊脂和培養基，為保證足夠的量，一個(gè)6孔板準備12 mL。

       3、首先加入6 mL的培養液到50 mL的錐形管，再加入6 mL的1%瓊脂溶液。將錐形管多次翻轉混勻，每個(gè)孔中迅速加入1.5 mL混合液，加混合液時(shí)不能產(chǎn)生氣泡。

       4、室溫靜置30 min，待下膠凝固。

鋪上膠：

       1、收獲的細胞用胰蛋白酶消化，用培養基以1:5的比例稀釋?zhuān)ㄈ? mL胰蛋白酶，加4 mL培養基），放入15 mL錐形管。

       2、細胞計數：以每孔5000個(gè)細胞作為起始，并根據需要進(jìn)行調整。

       3、細胞懸浮液的體積需要1.5 mL。一個(gè)6孔板準備12 mL細胞懸液。

       4、將熔化的0.6%瓊脂溶液放入裝有熱水（42°C）的桶中，在熱水里放一個(gè)50 mL的錐形管。將桶放入超凈臺內。

       5、以1:1的比例混合0.6%瓊脂溶液和細胞懸液，吸取6 mL細胞懸浮液到50 mL錐形管，再加入6 mL的0.6%瓊脂溶液?；靹蚝笱杆偌尤?孔板中，每孔1.5 ml。小心避免產(chǎn)生氣泡。

       6、室溫靜置30 min，待上膠凝固后放入細胞培養箱。

       7、足夠的菌落形成所需的時(shí)間因每個(gè)細胞系而異，通常為21天左右。每星期加兩次100 g的培養基以防止干燥。

  參考文獻：The Soft Agar Colony Formation Assay  DOI: 10.3791/51998