細胞培養基本概念

       細胞培養是指從體內組織取出細胞在體外模擬體內環(huán)境下，使其生長(cháng)繁殖，并維持其結 構和功能的一種培養技術(shù)。細胞培養的培養物可以是單個(gè)細胞，也可以是細胞群。

       細胞培養目的與用途

       1、科學(xué)研究：藥物研究開(kāi)發(fā)與基礎研究 藥物研究與開(kāi)發(fā)

       (1) 新藥篩選：如化學(xué)合成藥物藥效研究、中藥有效成分篩選與鑒定等。

       (2) 疫苗研究與開(kāi)發(fā)：如病毒性疫苗的研究與開(kāi)發(fā)（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、腫 瘤疫苗(多肽疫苗)等。

       (3) 基因工程藥物研究與開(kāi)發(fā)：如干擾素研究與開(kāi)發(fā)，細胞生長(cháng)因子研究與開(kāi)發(fā)等。

       (4) 細胞工程藥物研究與開(kāi)發(fā)：生物活性多肽研究與開(kāi)發(fā)，人參皂甙、紫杉醇等生物活 性成分研究與開(kāi)發(fā)。

       (5) 單克隆抗體制備：包括診斷用單克隆抗體，治療用單克隆抗體。

       基礎研究

       (1) 藥物作用機理

       (2) 基因功能

       (3) 疾病發(fā)生機理

       2、 生物制藥

       (1) 疫苗生產(chǎn)：如病毒性疫苗（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、腫瘤疫苗(多肽疫苗)等。

       (2) 基因工程藥物生產(chǎn)：如在臨床醫學(xué)中具有治療價(jià)值的一些細胞生長(cháng)因子如干擾素、 粒細胞生長(cháng)因子、胸腺肽等

       (3) 診斷用和藥用單克隆抗體生產(chǎn)

       (4) 細胞工程藥物生產(chǎn)：生物細胞內的一些生物活性多肽，生物活性物質(zhì)等

       細胞培養基本條件

       1、合適的細胞培養基

       合適的細胞培養基是體外細胞生長(cháng)增殖的最重要的條件之一，培養基不僅提供細胞營(yíng)養 和促使細胞生長(cháng)增殖的基礎物質(zhì)，而且還提供培養細胞生長(cháng)和繁殖的生存環(huán)境。

       2、優(yōu)質(zhì)血清

       目前，大多數合成培養基都需要添加血清。血清是細胞培養液中最重要的成分之一，含有細胞生長(cháng)所需的多種生長(cháng)因子及其它營(yíng)養成分。

       3、無(wú)菌無(wú)毒細胞培養環(huán)境

       無(wú)菌無(wú)毒的操作環(huán)境和培養環(huán)境是保證細胞在體外培養成功的首要條件。在體外培養 的細胞由于缺乏對微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物質(zhì)污染，或者 自身代謝物質(zhì)積累，可導致細胞中毒死亡。因此，在體外培養細胞時(shí)，必須保持細胞 生存環(huán)境無(wú)菌無(wú)毒，及時(shí)清除細胞代謝產(chǎn)物。

       4、恒定的細胞生長(cháng)溫度

       維持培養細胞旺盛生長(cháng)，必須有恒定適宜的溫度。

       5、合適的氣體環(huán)境

       氣體是哺乳動(dòng)物細胞培養生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。

       細胞培養基種類(lèi)與基本成分

       細胞培養基的種類(lèi)很多，按其來(lái)源分為合成培養基和天然培養基（目前使用的培養基 絕大部分是合成培養基），按其物質(zhì)狀態(tài)分為干粉培養基和液體培養基兩類(lèi)。干粉培養基 需由實(shí)驗者自己配制并滅菌，液體培養基由專(zhuān)業(yè)商家提供，用戶(hù)可直接使用，非常方便。 每種細胞都有其合適的培養基，詳見(jiàn)附表 1。

       1、合成培養基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、無(wú)機鹽、維生素及其它輔助物質(zhì)

       氨基酸

       氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同種類(lèi)的細胞對氨基酸的要求各異，但有幾種氨 基酸細胞自身不能合成，必須依靠培養液提供，這幾種氨基酸稱(chēng)為必需氨基酸。其中谷氨酰胺是細胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時(shí)，細胞生長(cháng)不良而死亡。

       因此，各種培養液中都有較大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩定，應 置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培養液內。已含谷氨酰胺的培養液在 4℃冰箱中儲 存 2 周以上時(shí)，還應重新加入原來(lái)量的谷氨酰胺。

碳水化合物

       碳水化合物是細胞生長(cháng)主要能量來(lái)源，其中有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸等。

       無(wú)機鹽

       培養液中無(wú)機鹽的主要功能是幫助細胞維持滲透壓平衡。此外，通過(guò)提供鈉，鉀和鈣 離子，幫助細胞調節細胞膜功能。培養液的滲透壓是一個(gè)非常重要的因素, 細胞通?？赡?受 260mOsm/kg ?320 mOsm/kg。標準培養液的滲透壓在此范圍內波動(dòng)。特別注意：向培 養液中加入其它物質(zhì)有可能會(huì )明顯改變培養液的滲透壓，特別是溶于強酸或強堿中的物 質(zhì)。向培養液中添加 HEPES 時(shí)需按以下方法調節鈉離子濃度。

       緩沖系統

       大多數細胞所需 pH 在 7.2 - 7.4。但是，細胞培養最適 pH 值隨培養的細胞種類(lèi)不同而 不同。成纖維細胞喜歡較高 pH (7.4 - 7.7), 而傳代轉化細胞系則需要偏酸 pH (7.0 - 7.4)。 由于多數培養液靠碳酸氫鈉（NaHCO3）與 CO2 體系進(jìn)行緩沖，因此，氣相中的 CO2 濃度 應與培養液中碳酸氫鈉濃度相平衡。如果氣相或培養箱空氣中 CO2 濃度設定在 5％，培養液中 NaHCO3 的加入量為 1.97g/L；如果 CO2 濃度維持在 10％，培養液中 NaHCO3 的加入量為 3.95g/L。細胞培養瓶蓋不應擰得太緊，以保證氣體交換。

       HEPES 是一種非離子緩沖液，在 pH 7.2 - 7.4 范圍內具有較好的緩沖能力，但是非 常昂貴，在高濃度時(shí)對一些細胞可能有毒。HEPES 緩沖液可與低水平的碳酸鈉（0.34g/L） 共用，以抵消因額外加入 HEPES 引起的滲透壓增加。在這種培養條件下，細胞培養瓶的 蓋子應擰緊，以防止培養液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。大多數培養液中含有酚紅作 為 pH 指示劑，酸性培養液呈橙黃色，堿性培養液呈深紅色。

       維生素

       在細胞培養中，盡管血清是維生素重要來(lái)源， 但是許多培養基中添加了各種維生素以 適合更多的細胞系生長(cháng)。

       其它成分

       在一些較為復雜的培養液中還包括其它一些成分。如在雜交瘤技術(shù)中常用的 DMEM 培 養液，使用時(shí)還需要補加丙酮酸鈉和 2-巰基乙醇（2-Mercaptoethanol，2-Me）。2-Me 對細 胞生長(cháng)有很重要的作用。有人認為它相當于胎牛血清，有直接刺激細胞增殖作用。2-Me 的活性部分是硫氫基，其中一個(gè)重要作用是使血清中含硫的化合物還原成谷胱甘肽，能誘 導細胞的增殖，為非特異性的激活作用。同時(shí)避免過(guò)氧化物對培養細胞的損害。另一個(gè)重 要作用是促進(jìn)分裂原的反應和 DNA 合成，增加植物凝集素(PHA)對淋巴細胞的轉化作用， 已廣泛應用于雜交瘤技術(shù)，另外，也開(kāi)始用于一些難以培養的細胞。2-Me 是一種小分子 還原劑，極易氧化。分子量為 78.13，純的 2-Me 是一種無(wú)色有刺激味的液體，比重為1.110-1.120(Do20)，常用終濃度為 5×10-5M。常配制成 0.1M 的儲存液，用時(shí)每升培養液 加 0.5ml。

       液體培養基保存：

       液體培養基應于 4℃冰箱避光保存，實(shí)驗前放入 37℃預熱。未加血清液體培養基有 效期為 12 個(gè)月。液體培養基中的 L-谷氨酰胺會(huì )隨著(zhù)儲存時(shí)間的延長(cháng)而慢慢分解。如果 細胞生長(cháng)不良，可以再添加適量 L-谷氨酰胺。

       干粉培養基保存：4℃冰箱避光保存，有效期 36 個(gè)月。

       血清

       細胞培養液中添加的血清有牛血清、馬血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清， 分為胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是從母牛破腹取出的胎牛中分離出的血清，價(jià)格 昂貴。新生小牛血清是從剛出生的尚未哺乳的小牛中分離出來(lái)的血清，如廠(chǎng)家能做到這一 點(diǎn)，新生小牛血清的質(zhì)量與胎牛血清的質(zhì)量相差不大。如小牛出生后已哺乳，從這種小牛 中取出的血清中可能含有較多的生物活性物質(zhì)，其質(zhì)量明顯不如前兩種。

       血清的質(zhì)量，種類(lèi)及使用的濃度都有可能影響細胞的生長(cháng)，而不同批次的血清支持細 胞生長(cháng)的能力也不同，尤其是對克隆細胞的生長(cháng)，某些批次血清可能含有毒性或抑制細胞 生長(cháng)的物質(zhì)。因此，在購買(mǎi)大量血清之前，必須對血清支持細胞生長(cháng)能力進(jìn)行檢測，然后再，然后大量購買(mǎi)質(zhì)量好的同一批號的血清，并注意以下幾點(diǎn)：

       （1）需要長(cháng)期保存的血清必須儲存于-20℃ – 70℃ 低溫冰箱中。4℃冰箱中保存時(shí)間切 勿超過(guò) 1 個(gè)月。由于血清結冰時(shí)體積會(huì )增加約 10％，因此，血清在凍入低溫冰箱前， 必須預留一定體積空間，否則易發(fā)生污染或玻璃瓶?jì)隽选?/span>

       （2）一般廠(chǎng)商提供的血清為無(wú)菌，無(wú)需再過(guò)濾除菌。如發(fā)現血清有懸浮物，則可將血清 加入培養液內一起過(guò)濾，切勿直接過(guò)濾血清。

       （3）瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法：-20℃ 至 -70℃ 低溫冰箱中的血清放入 4℃冰箱 中溶解 1 天。然后移入室溫，待全部溶解后再分裝。在溶解過(guò)程中需不斷輕輕搖晃均 勻（小心勿造成氣泡），使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。切勿直接將血清從-20℃進(jìn)入 37℃解凍，這樣因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝集而出現沉淀。

       （4）熱滅活是指 56℃, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清。加熱過(guò)程中須規則搖晃均勻。此 熱處理的目的是使血清中的補體成分（complement）滅活。除非必須，一般不建議作 此熱處理，因為熱處理會(huì )造成血清沉淀物顯著(zhù)增多，而且還會(huì )影響血清的質(zhì)量。補體 參與反應有：細胞毒作用, 平滑肌細胞收縮, 肥大細胞和血小板釋放組胺, 增強吞噬 作用, 促進(jìn)淋巴細胞和巨噬細胞發(fā)生化學(xué)趨化和活化。

       （5）切勿將血清在 37℃放置太久，否則血清會(huì )變得渾濁，同時(shí)血清中的有效成分會(huì )破會(huì ) 而影響血清質(zhì)量。

       （6）血清中的沉淀物 絮狀物：主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會(huì )影響血清本身的質(zhì)量?？捎秒x心 3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理。

       顯微鏡下“小黑點(diǎn)”：經(jīng)過(guò)熱處理過(guò)的血清，沉淀物的形成會(huì )顯著(zhù)增多。有些沉淀物 在顯微鏡下觀(guān)察象“小黑點(diǎn)”，常誤認為血清受污染。一般情況下，此小黑點(diǎn)不會(huì )影 響細胞生長(cháng)，但如果懷疑血清質(zhì)量，則應立即停止使用，更換另一批號的血清。（轉載）