遷移實(shí)驗（cell migration assay）

實(shí)驗材料

（1）ThinCert插入式細胞培養器: 24-well, 8.0-μm pore membranes (Greiner 662638) 

（2）細胞培養相關(guān)試劑：無(wú)血清培養基，10％血清培養基，PBS，0.02％EDTA 

（3）固定液：甲醇

（4）染色液：Giemsa染液

（5）封片劑：中性樹(shù)膠

（6）其他：小鑷子，棉棒，載玻片，蓋玻片

操作步驟

（1）所有細胞培養試劑和ThinCert放在37℃溫育；

（2）待測細胞培養至對數生長(cháng)期，消化細胞，用PBS和無(wú)血清培養基先后洗滌一次，

用無(wú)血清培養基懸浮細胞，計數，調整濃度為2×105 /ml；

（3）在下室（即24孔板底部）加入600－800μl 含10％血清的培養基，上 室加入

100－150μl細胞懸液，繼續在孵箱培養24小時(shí)；

（4）用鑷子小心取出ThinCert，吸干上室液體，移到預先加入約800μl甲醇的孔中，

室溫固定30分鐘；

（5）取出ThinCert，吸干上室固定液，移到預先加入約800μl Giemsa染液 的孔中，

室溫染色15－30分鐘；

（6）輕輕用清水沖洗浸泡數次，取出ThinCert，吸去上室液體，用濕棉棒小 心擦去

上室底部膜表面上的細胞；

（7）用小鑷子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至載玻片上用中性樹(shù)膠封片；

（8）顯微鏡下取9個(gè)隨機視野計數，統計結果。

注意事項

（1）根據待測細胞體積大小選擇合適孔徑的ThinCert。常用的為8.0-μm孔徑

（如AGS細胞），如果細胞體積較大可以考慮用10-μm孔徑；

（2）根據待測細胞的遷移能力強弱調整細胞數和遷移時(shí)間。常規24-well 

ThinCert接種細胞數約為2≈5×104/well，遷移時(shí)間12≈36小時(shí)；

（3）由于Greiner公司的24-Transwell內含24個(gè)獨立的ThinCert，為了避免

操作污染，每次實(shí)驗可預先另準備一塊24孔普通培養板（Greiner）；

（4）如果細胞遷移能力較弱，下室液體可用3T3細胞無(wú)血清培養24小時(shí)獲得的

上清加50μg/ml FN（Fibronectin），具體可查閱相關(guān)文獻；

（5）細胞懸液加入膜中央，盡量保證液面水平；

（6）固定染色擦洗時(shí)動(dòng)作小心，避免擦去膜底面的細胞。但一定要充分擦凈膜

表面上未遷移的細胞，以免影響讀數。尤其是膜周邊上可用細牙簽或小鑷
子纏上濕棉花擦洗，但要小心避免將膜戳破；

（7）Chamber和膜上都無(wú)法標記，操作時(shí)應小心避免混淆實(shí)驗組和對照組；

（8）充分晾干，避免殘留水分導致鏡下聚焦不一致。

細胞侵襲實(shí)驗（cell invasion assay）

實(shí)驗材料

（1）Matrigel (BD 5mg/ml)，-20℃保存
（2）其余材料同遷移實(shí)驗


操作步驟

（1）Matrigel在4℃隔天融化；

（2）用4℃預冷的無(wú)血清培養基稀釋Matrigel至終濃度1mg/ml，冰上操作；

（3）在chamber上室底部中央垂直加入100μl稀釋后的Matrigel，37℃溫育 

4－5小時(shí)使其干成膠狀；

（4）后續步驟同遷移實(shí)驗（1-8）。

注意事項
（1）Matrigel在過(guò)高或過(guò)低的溫度均易凝固，因此操作所需槍頭和離心管應提前在4℃
預冷；
（2）鋪膠時(shí)保證液面水平，膠的厚度均勻一致，切勿產(chǎn)生氣泡；
（3）其他注意事項同遷移試驗。