為避免污染造成的損失，最小化連續細胞系的遺傳改變和避免有限細胞系的老化和轉化，需要凍存哺乳細胞。凍存細胞前，細胞應該特性化并檢查是否污染。

     有幾種普通培養基用來(lái)凍存細胞。對于包含有血清的培養基，成分可能如下：

◆包含10%甘油的完全培養基，

◆包含10%二甲基亞砜（DMSO）的完全培養基，

◆50%細胞條件培養基和50%含有10%甘油的新鮮培養基，

◆50%細胞條件培養基和50%含有10%二甲基亞砜的新鮮培養基。

        對于無(wú)血清培養基，一些普通的培養基成分可能是：

◆50%細胞條件無(wú)血清培養基和50%包含有7.5%二甲基亞砜的新鮮的無(wú)血清培養基，或

◆包含有7.5%二甲基亞砜和10%細胞培養級BSA的新鮮無(wú)血清培養基。

●計數將要凍存的活細胞。細胞應該處于對數生長(cháng)期。以大約200～400 g離心5分鐘沉淀細胞，使用移液管移去上清到最小體積，不要攪亂細胞。

●以1×107到5×107細胞/ml密度，在包含有血清的冷凍培養基中再次懸浮細胞，或者以0.5×107到1×107在無(wú)血清培養基中，再次懸浮細胞。

●分裝進(jìn)凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內開(kāi)始冷凍步驟。

●細胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍，可以通過(guò)可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉移到液氮中貯存。

●使用分離試劑從基層分離細胞，分離時(shí)盡可能溫和，使對細胞的損傷減少到最小。

●在完全生長(cháng)培養基中，再次懸浮分離細胞，確定有活力細胞數。

●以大約200 g離心5分鐘沉淀細胞。使用移液管移去上清到最小體積，不要攪亂細胞。

●以5×106到1×106細胞/ml密度，在凍存液中懸浮細胞。

●分裝進(jìn)凍存管，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內開(kāi)始冷凍步驟。

●細胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍，可以通過(guò)可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉移到液氮中貯存。

     凍存細胞較脆弱，要輕柔操作。凍存細胞要快速融化，并直接加入完全生長(cháng)培養基中。若細胞對凍存劑（DMSO或甘油）敏感，離心去除凍存培養基，然后加入完全生長(cháng)培養基中。

         ●取出貯存細胞，37℃水浴中快速融化。

         ●直接用完全生長(cháng)培養基鋪板細胞。1 ml凍存細胞使用10~20 ml完全生長(cháng)培養基。進(jìn)行活細胞計數，細胞接種應該至少在3×105活細胞/ml。

         ●培養細胞12到24小時(shí)，更換新鮮的完全生長(cháng)培養基，去除凍存劑。

（2）離心方法

         ●取出貯存細胞，37℃水浴中快速融化。

        ●把1到2 ml凍存細胞加入到大約25 ml完全生長(cháng)培養基，輕輕混勻。

        ●以大約80x g離心2到3分鐘。

         ●棄去上清。

         ●在完全生長(cháng)培養基輕輕再次懸浮細胞，并且進(jìn)行活細胞計數。

         ●細胞鋪板，細胞接種應該至少為3×105活細胞/ml。