分離純化方法已成為目前的研究熱點(diǎn)之一。蛋白質(zhì)的分離純化工作較為復雜，從細胞中提取的蛋白質(zhì)或從含有蛋白質(zhì)的溶液中經(jīng)過(guò)沉淀、梯度離心、鹽析等方法得到的蛋白質(zhì)經(jīng)常含有雜質(zhì)。要去除這些雜質(zhì)，同時(shí)又要保持蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，如酶的催化活性，就需要根據不同的蛋白質(zhì)制定出相應的策略，采用不同的方法。

一、沉淀法

1、鹽析

實(shí)驗原理：中和蛋白質(zhì)表面電荷并破壞水化膜。

蛋白質(zhì)易溶于水，因為其分子的-COOH -NH2和-OH都是親水基團，這些基團與極性水分子相互作用形成水化層，包圍于蛋白質(zhì)分子周?chē)纬?~100 nm大小的親水膠體，從而削弱了蛋白質(zhì)分子之間的作用力。當大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的 SO42- 和NH4+）有很強的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之"失水"，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結并沉淀析出。

2、等電點(diǎn)沉淀法：

實(shí)驗原理：利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低而各種蛋白質(zhì)又具有不同等電點(diǎn)的特點(diǎn)進(jìn)行分離的方法。

在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子以?xún)尚噪x子形式存在，其分子凈電荷為零(即正負電荷相等)，此時(shí)蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中因沒(méi)有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產(chǎn)生沉淀，所以蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，其溶解度最小，最易形成沉淀物。

注意點(diǎn)：不同的蛋白質(zhì)，具有不同的等電點(diǎn)。同一種蛋白質(zhì)在不同條件下，等電點(diǎn)不同。

 3、有機溶劑沉淀法

實(shí)驗原理：加入有機溶劑使水溶液的介電常數降低，因而增加了兩個(gè)相反電荷基團之間的吸引力，促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集和沉淀。

有機溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的另一種解釋認為與鹽析相似，有機溶劑與蛋白質(zhì)爭奪水化水，致使蛋白質(zhì)脫除水化膜，而易于聚集形成沉淀。

影響因素：(一)有機溶劑的選擇 (二)溫度的控制 (三)pH值 (四)離子強度 

用此法析出的沉淀一般比鹽析法易過(guò)濾或離心沉降，分離后的蛋白質(zhì)沉淀應立即用水或者緩沖液溶解，以達到降低有機溶劑的濃度的目的。此法在血液制品的制備過(guò)程中較多使用。

二、層析

1、離子交換柱層析

實(shí)驗原理：以離子交換劑為固定相，依據流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。是發(fā)展最早的層析技術(shù)之一，目前已成為蛋白質(zhì)分離純化最常用的手段，是基于蛋白質(zhì)電荷不同的分離技術(shù)。

離子交換層析中，基質(zhì)是由帶有電荷的樹(shù)脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱(chēng)之陰離子交換樹(shù)脂；而帶有負電荷的稱(chēng)之陽(yáng)離子樹(shù)脂。陰離子交換基質(zhì)結合帶有負電荷的蛋白質(zhì)，所以這類(lèi)蛋白質(zhì)被留在柱子上，然后通過(guò)提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。結合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來(lái)。反之陽(yáng)離子交換基質(zhì)結合帶有正電荷的蛋白質(zhì)，結合的蛋白可以通過(guò)逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來(lái)。

2、疏水相互作用層析

實(shí)驗原理：根據分子表面疏水性差別來(lái)分離蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的一種較為常用的方法。

蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的表面常常暴露著(zhù)一些疏水性基團，我們把這些疏水性基團稱(chēng)為疏水補丁，疏水補丁可以與疏水性層析介質(zhì)發(fā)生疏水性相互作用而結合。不同的分子由于疏水性不同，它們與疏水性層析介質(zhì)之間的疏水性作用力強弱不同，疏水作用層析就是依據這一原理分離純化蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的。

3、親和層析

實(shí)驗原理：利用蛋白質(zhì)能和某些專(zhuān)一分子可逆結合的特性，當蛋白質(zhì)溶液通過(guò)層析柱時(shí)，其中可與親和載體配基相互作用的受體被吸附劑結合，不被吸附的無(wú)關(guān)成分則可隨流出液通過(guò)柱體，從而將吸附蛋白與其他蛋白質(zhì)分開(kāi)。此法特異性強，收率高。

4、凝膠層析

實(shí)驗原理：根據分子大小分離蛋白混合物的最有效的方法之一?；旌衔镫S流動(dòng)相流經(jīng)裝有凝膠固定相的層析柱時(shí)，其中各物質(zhì)因分子大小的的不同而被分離的技術(shù)。

三、離心

1、速率區帶離心法

實(shí)驗原理根據分離的粒子在離心力作用下，因其在梯度液中沉降速度的不同，離心后具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內，形成幾條分開(kāi)的樣品區帶，達到彼此分離的目的。

由于此法是一種不完全的沉降，沉降受物質(zhì)本身大小的影響較大，一般是應用在物質(zhì)大小相異而密度相同的情況。容量小，只能用于少量的制備。

2、差速離心法

實(shí)驗原理：利用樣品中各組分沉降系數的差異，對不同的微粒施以不同的離心力，經(jīng)過(guò)多次離心，離心速度逐步加大，將不同的微粒依次沉降，從而實(shí)現離心分離。

四、膜分離

1、超濾法

是利用加壓膜分離技術(shù)，在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過(guò)一定孔徑的特制薄膜，大分子溶質(zhì)滯留，從而使大分子物質(zhì)得到部分的純化。常和離子交換，凝膠過(guò)濾聯(lián)合使用。

2、透析

是利用小分子經(jīng)過(guò)半透膜擴散到水( 或緩沖液) 的原理，將無(wú)機鹽等小分子與生物大分子分開(kāi)的一種分離純化技術(shù)，常和鹽析，鹽溶等方法聯(lián)合使用。