實(shí)驗室里，我們常聽(tīng)到，“你的flag砸（雜）出來(lái)了么？”

“頭大啊~沒(méi)有呢，我打算換個(gè)tag試試?！?/span>

重組蛋白表達技術(shù)現已在生物學(xué)各個(gè)具體領(lǐng)域應用廣泛，尤其是蛋白質(zhì)的大規模生產(chǎn)和體內功能研究都需要應用重組蛋白表達載體。 

而蛋白標簽是指利用DNA體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達、檢測、示蹤和純化等。下面中洪君將為你講解各種不同功能的蛋白標簽及其優(yōu)缺點(diǎn)，便于助大家選擇。

蛋白純化標簽比較

一. 常用的蛋白標簽有哪些？

HIS標簽

His標簽是當前最為熱門(mén)的標簽蛋白之一。His6是指六個(gè)組氨酸殘基組成的融合標簽，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。當某一個(gè)標簽的使用，一是能構成表位利于純化和檢測；二是構成獨特的結構特征（結合配體）利于純化。組氨酸殘基側鏈與固態(tài)的鎳有強烈的吸引力，可用于固定化金屬螯合層析（IMAC），對重組蛋白進(jìn)行分離純化。

Flag-tag

Flag標簽蛋白為編碼8個(gè)氨基酸的親水性多肽（DYKDDDDK），同時(shí)載體中構建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合蛋白在真核表達系統中表達效率更高。

AviTag

是一個(gè)15個(gè)氨基酸的短肽，具有一個(gè)單生物素化賴(lài)氨酸位點(diǎn)，與已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目標蛋白的N端和C端。融合表達后，可被生物素連接酶生物素化，為了純化重組蛋白選用低親和性的單體抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白質(zhì)分離純化，還用于蛋白質(zhì)相互作用研究。

SNAP-Tag 

SNAP-Tag是從人的O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉移（O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase）獲得。SNAP所帶的活性巰基位點(diǎn)接受了苯甲基鳥(niǎo)嘌呤所攜帶的側鏈苯甲基基團，釋放出了鳥(niǎo)嘌呤。這種新的硫醚鍵共價(jià)結合使SNAP所帶的目的蛋白攜帶上了苯甲基基團所帶的標記物。 

檢測：生物素或各種顏色熒光的底物（如熒光素、若丹明）可滲透進(jìn)入細胞，方便快捷地進(jìn)行活細胞內SNAP-Tag融合蛋白的標記與檢測。它們也可特異性地標記大腸桿菌，酵母和哺乳動(dòng)物等細胞抽提液或已經(jīng)純化的蛋白液中的SNAP-tag融合蛋白。 

將純化的或未純化的SNAP-Tag融合蛋白與表面固定了苯甲基鳥(niǎo)嘌呤的基質(zhì)混合，蛋白即可特異與底物作用，形成共價(jià)鍵，融合蛋白間接被固定在了基質(zhì)表面上，可以達到更方便快捷地研究蛋白功能或純化蛋白的目的。  

GST（谷胱甘肽巰基轉移酶）

GST標簽蛋白本身是一個(gè)在解毒過(guò)程中起到重要作用的轉移酶，它的天然大小為26KD。GST融合表達系統廣泛應用于各種融合蛋白的表達，可以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細胞中表達。結合的融合蛋白在非變性條件下用10mM還原型谷胱甘肽洗脫。GST標簽可用酶學(xué)分析或免疫分析很方便的檢測。標簽有助于保護重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩定性。

純化：該表達系統表達的GST標簽蛋白可直接從細菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠親和樹(shù)脂進(jìn)行純化。

如果要去除GST融合部分，可用位點(diǎn)特異性蛋白酶切除。

檢測：可用GST抗體或表達的目的蛋白特異性抗體檢測。

GFP

GFP（綠色螢光蛋白）是由下村修等人在水母中發(fā)現的。它在藍色波長(cháng)范圍的光線(xiàn)激發(fā)下，會(huì )發(fā)出綠色螢光。GFP標簽可位于蛋白質(zhì)的C端或N端，該系統已廣泛應用于各種細胞類(lèi)型，包括細菌、酵母和哺乳動(dòng)物細胞等，相應的GFP標簽抗體也被廣泛應用。GFP在檢測蛋白表達、蛋白和細胞熒光示蹤、研究蛋白質(zhì)之間相互作用和構象變化中，起到了重要的作用。

常規化的c-Myc

C-Myc標簽蛋白，是一個(gè)含11個(gè)氨基酸的小標簽，它作為抗原表位表達在不同的蛋白質(zhì)框架中可識別其相應抗體。C-Myc tag已成功應用在Western-blot雜交技術(shù)、免疫沉淀和流式細胞計量術(shù)中，可用于檢測重組蛋白質(zhì)在靶細胞中的表達。

熒光素酶（luciferase）:

來(lái)源于生物體內的熒光素，常見(jiàn)的有螢火蟲(chóng)熒光素酶、海腎熒光素酶和Guassia熒光素酶。這些熒光素酶作為“報告蛋白”被用于分子生物學(xué)研究中，這種技術(shù)被稱(chēng)為報告基因檢測法或螢光素酶檢測法（Luciferase Assay）。跟普通融合蛋白標簽不同，使用熒光素酶構建的報告基因可用作目的基因的定量分析。因此常用于研究啟動(dòng)子、miRNA 3'UTR克隆的功能與調控，因為它們對目的基因的調控可以是漸變的，而不是簡(jiǎn)單的開(kāi)和關(guān)兩種狀態(tài)。

二、常用蛋白標簽優(yōu)缺點(diǎn)對比

三、 該如何選擇表達克隆的標簽

1、首先，需要確定融合標簽的目的

蛋白純化 ：標簽的普遍用途是蛋白純化。小分子6XHis Tag常被用于細胞內源蛋白的純化。6XHis Tag也廣泛應用于大腸桿菌的蛋白純化?？墒遣溉閯?dòng)物細胞中因非分泌蛋白自身存在高組氨酸背景，因此極少使用6XHis Tag。

Western Blot檢測：若需要做Western Blot實(shí)驗來(lái)檢測細胞裂解物中蛋白的表達，你可以選擇有匹配的抗體的小分子標簽。FLAG? Tag以其分子量小以及擁有許多與之匹配的商業(yè)化的抗體等優(yōu)勢，成為Western Blot實(shí)驗中常用的Tag。

免疫沉淀反應：FLAG? Tag其分子量小以及擁有大量相匹配的商業(yè)用抗體等優(yōu)勢成為免疫沉淀反應中最常用的Tag. 其他常用的標簽有：HA和cMyc.

活細胞成像：熒光蛋白（Fluorescent Proteins, FPs）是活細胞成像常用的標記蛋白。其中最常用的是綠色熒光蛋白（GFP）和它的衍生物（CFP, YFP, etc.），以及一些紅色變體，如dTomato和mCherry.

2、考慮融合標簽的影響

任何一類(lèi)標簽處于氨基酸序列的任一位置，都具有影響目的蛋白表達或功能的可能性。最主要原因是標簽可能會(huì )干擾蛋白的正確折疊，致使目的蛋白失活或形成包涵體。其次，標簽可能會(huì )中斷亞細胞定位信號，這種情況下，蛋白能夠正確翻譯和折疊，但在細胞內所處的位置是錯誤的。因此，您需要知道添加的標簽對目的蛋白的表達是否有影響。

3、考慮是在N-端還是C-端標記

N-端或C-端標記的選擇還需要根據蛋白結構、定位等特性。然而，倘若你沒(méi)有確切的蛋白結構，或蛋白功能域圖譜，建議分別構建N-端標記和C-端標記的表達克隆，以檢測哪個(gè)更有效。