純化是注定辛苦的旅行

路上少不了篩選和優(yōu)化

但那又怎樣

哪怕運行千遍

也要純得漂亮

我是中洪博元蛋白組，我為自己代言！

以蛋白質(zhì)和結構與功能為基礎，從分子水平上認識生命現象，已經(jīng)成為現代生物學(xué)發(fā)展的主要方向，研究蛋白質(zhì)，首先要得到高度純化并具有生物活性的目的物質(zhì)。

一. 實(shí)驗試劑及材料

實(shí)驗材料：大腸桿菌BL21

試劑、試劑盒：LB液體培養基、 氨芐青霉素、 Washing Buffer Elution Buffer IPTG 、蒸餾水 、胰蛋白胨 、酵母粉、 氯化鈉

儀器、耗材：搖床 、離心機、 層析柱、 離心管、 移液槍、 槍頭盒 、燒杯 、玻璃棒

（實(shí)拍圖，請勿盜用）

二. 獲得目的基因

1.通過(guò)PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。

2.通過(guò)RT-PCR方法：用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉錄形成cDNA第一鏈，以逆轉錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

三. 構建重組表達載體

1.載體酶切：將表達質(zhì)粒用限制性?xún)惹忻福ㄍ锏拿盖形稽c(diǎn)）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

2.PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

四. 獲得含重組表達質(zhì)粒的表達菌種

1.將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α，根據重組載體的標志（抗Amp或藍白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。

2.測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應篩選更多克隆，重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。

3.以此重組質(zhì)粒DNA轉化表達宿主菌的感受態(tài)細胞。

五. 氯霉素?；D移酶重組蛋白的誘導

1.接種含有重組氯霉素?；D移酶蛋白的大腸桿菌BL21菌株于5 mL LB液體培養基中（含100 ug/mL 氨芐青霉素），37℃震蕩培養過(guò)夜。

2.按1∶50或1：100的比例稀釋過(guò)夜菌，一般轉接1 mL過(guò)夜培養物于100 mL（含100 ug/mL 氨芐青霉素）LB液體培養基中，37℃震蕩培養至OD600 = 0.6 - 0.8（最好0.6，大約需3 h）。取10 ul 樣品用于SDS-PAGE 分析。
 

3.對照組不加誘導劑，實(shí)驗組加入IPTG至終濃度0.5 mmol/l，37℃繼續培養1-3h。

4.12 000 rpm 離心10 min，棄上清，菌體沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。

六. 氯霉素?；D移酶重組蛋白的分離、純化 

1.NTA層析柱的準備：在層析柱中加入1 mL NTA介質(zhì)，并分別用8 mL 去離子水，8 mL上樣緩沖液洗滌。

2.重組蛋白的變性裂解：在冰浴中凍融菌體沉淀，加入5 mL上樣緩沖液， 用吸管抽吸重懸，超聲波破裂菌體，用振蕩器等輕柔的混勻樣品60 min，4℃ 12000 rpm 離心 30 min，將上清吸至一個(gè)干凈的容器中，并棄沉淀。取10 ul 上清樣品用于SDS-PAGE 分析。

3.上清樣品以10-15 mL/h 流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液，取10 ul樣品用于SDS-PAGE 分析。
 

4.洗脫雜蛋白：用Washing Buffer以10-15 mL/h流速洗柱，直至OD280 = 0.01分步收集洗脫液，約3-4 h，取10 ul洗脫開(kāi)始時(shí)的樣品用于SDS-PAGE 分析。
 

5.洗脫目標蛋白：用Elution Buffer洗柱，收集每1 mL 級分，分別取10 ul樣品用于SDS-PAGE 分析。

七. 注意事項

1.選擇表達載體時(shí)，要根據所表達蛋白的最終應用考慮。如為方便純化，可選擇融合表達；如為獲得天然蛋白，可選擇非融合表達。

2.融合表達時(shí)在選擇外源DNA同載體分子連接反應時(shí)，對轉錄和轉譯過(guò)程中密碼結構的閱讀不能發(fā)生干擾。

3.  菌液OD值要小于1，否則細胞太濃太老，不易破碎，且質(zhì)粒易丟失。

4.  誘導時(shí)間最好做一個(gè)梯度，不同蛋白誘導時(shí)間需摸索。

5.  誘導溫度適當摸索：25、30℃。

6.  IPTG濃度：一般在1 mM 以?xún)?，可適當摸索。

7.  超聲條件可視實(shí)際情況改變，只要使菌體裂解充分即可，即菌液清亮不粘稠。