編者的話(huà)：對一些剛入門(mén)的科研小白們來(lái)說(shuō)，免疫組化步驟較為繁瑣，一步錯，則步步錯。也有很多實(shí)驗伙伴向中洪君吐槽，明明覺(jué)得都按照老師們提供的條件做，可惜就是沒(méi)有得到預期結果。今天中洪老司機就教大家這樣做！

1、石蠟切片和冰凍切片的選擇比較

2、一抗的選點(diǎn)和技巧

（1）單克隆和多克隆抗體的選擇。單克隆和多克隆抗體的內在特征決定了它們用于IHC/ICC時(shí)的優(yōu)勢和限制。單克隆抗體由單個(gè)B細胞克隆產(chǎn)生，代表了同質(zhì)群體，能夠高親和力高特異性地與單個(gè)表位結合。這在檢測蛋白家族的某個(gè)成員時(shí)特別有用，因為蛋白家族有著(zhù)高比例的氨基酸同源性。

抗體結合往往依賴(lài)于目標蛋白維持其天然的構想狀態(tài)。與其他蛋白的相互作用、翻譯后修飾、溫度、pH、固定和鹽濃度都會(huì )影響抗體接近目的表位。多克隆抗體是異質(zhì)的，可識別多個(gè)表位，因此它們較少受到蛋白構象變化的影響。

一般而言，多克隆抗體在一定pH和鹽濃度范圍內也比單克隆抗體更為穩定?；谶@些原因，多克隆抗體更常用于IHC/ICC實(shí)驗。

（2）應用范圍的選擇。有的一抗只能用于Western Blotting,或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等;甚至表明石蠟切片或冰凍切片。

（3）種屬反應性的選擇。這一點(diǎn)很重要，表明這種抗體可能存在種屬差異，且這種抗體適合檢測哪種種屬動(dòng)物體內的抗原。

（4）種屬來(lái)源，一般兔來(lái)源的多是多克隆;而小鼠來(lái)源的多是單克隆，但也有另外。根據此來(lái)源來(lái)選擇相應的二抗。

（5）生產(chǎn)廠(chǎng)家的選擇。

3、封閉血清的選擇原則

（1）膜上或切片上有剩余的位點(diǎn)可以非特異性吸附抗體，造成后續結果的假陽(yáng)性。

（2）封閉血清一般是和二抗同一來(lái)源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，預先能和組織中有交叉反應的位點(diǎn)發(fā)生結合，否則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結合，會(huì )造成背景。

（3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來(lái)源一致。

4、PBS 的清洗方式選擇、次數和時(shí)間的選擇

（1）單獨沖洗，防止交叉反應造成污染?！?/span>

臨床上每天檢測的病例很多，所用的抗體種類(lèi)及項目也多，如果在加入一抗孵育完后，將它們在一個(gè)缸內洗，這樣就會(huì )造成交叉污染，影響最后的結果。正確的做法是單獨地進(jìn)行沖洗，沖洗的 PBS 為一次性，保證切片沒(méi)有相互交叉污染的機會(huì )。

（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。

沖洗切片，取出切片，將 PBS 從上輕輕地沖洗，讓 PBS 自上而下流下來(lái)，不要拿起切片將 PBS 對準切片沖洗，這樣由于沖出的 PBS 有一定的沖擊力，很容易使切片周邊引起松動(dòng)，導致切片的脫落。

（3）沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結合的物質(zhì)。

沖洗切片有人提出用微振蕩器振染，振下未結合的各種物，使之不產(chǎn)生背景，此種做法一是浪費時(shí)間，二是很容易導致切片的脫落。切片的沖洗據實(shí)踐認為，用一小燒杯柔和地于切片上沖洗，就能徹底沖洗去未結合的物質(zhì)，無(wú)需附加其它條件，沖洗好于切片上再注入 PBS，持續 2 min 左右就完全足夠了。

5、一抗 4℃ 孵育后為什么要進(jìn)行 37℃復溫？

（1）一方面，防止切片從 4oC 直接放入 PBS 易脫片。

（2）另一方面，使抗原抗體結合更穩定。一般不需要，但對表達較弱的抗原可能有用，4oC 和 37oC 時(shí)分子運動(dòng)方式不同，前者分子碰撞機率和運動(dòng)速度小于后者,后者結合更快，但敏感性也提高了并易造成非特異染色。

6、免疫組化結果如何分析

（1）陽(yáng)性著(zhù)色細胞計數法。在 40 * 光鏡下，隨機選擇不重疊的 10 個(gè)視野，人工或機器計數陽(yáng)性著(zhù)色細胞，每組 3-6 張不同動(dòng)物組織切片，然后進(jìn)行組間比較即可。

（2）灰密度分析法。通過(guò)在不同組別和不同動(dòng)物組織切片上選擇相同區域、相同條件下用 image j 進(jìn)行灰密度分析，然后進(jìn)行統計分析即可。

（3）評分法。通過(guò)在光學(xué)顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（0-3 分為陰性著(zhù)色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽(yáng)性范圍進(jìn)行評分（1-4 分為 0-25%、26-50%、51-75%、76-100%），最終可以分數相加，再進(jìn)行比較。

對于以上這幾種方法，各有利弊，請細心選擇。要想得到正確結果的前提是你要做出著(zhù)色均勻、背景很淺的高質(zhì)量切片。