中洪實(shí)拍孵育抗體圖

抗體孵育流程

1、把封閉好的膜放在密閉塑料袋或者培養皿中，加入一抗溶液孵育。搖床上緩慢搖動(dòng)，4℃過(guò)夜。

2、用洗膜緩沖液漂洗PVDF膜2次，每次7min。把膜放在密閉塑料袋或者培養皿中，加入二抗溶液孵育。搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫1h。

3、用洗膜緩沖液漂洗PVDF膜3次，每次7min。

抗體哪家強？

WB實(shí)驗里面最為昂貴的產(chǎn)品可能就是抗體了，知名的抗體品牌很多，Abcam，CST，Millipore，BD，Santa，R&D等都是實(shí)驗中常用的國外品牌，國內品牌Boster還可以，但是在WB領(lǐng)域建議首選CST，因為CST性?xún)r(jià)比相對較高，且使用濃度一般按推薦的就可以了，抗體效價(jià)高。

當然由于CST抗體產(chǎn)品種類(lèi)遠遠不能滿(mǎn)足每一位研究者的需要，那么就需要大家在其他如Abcam、Millipore等品牌中選擇需要的抗體，這里建議大家的是選擇抗體的時(shí)候，最好看看說(shuō)明書(shū)里面是否有可供參考的驗證圖片或者有文獻使用了該抗體發(fā)表的圖片，因為圖片可以在很大程度上看出抗體的特異性如何。

內參抗體的選擇

內參即是內部參照（Internal Control），對于哺乳動(dòng)物細胞表達來(lái)說(shuō)一般是指由管家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時(shí)常用它來(lái)做參照物，以校正蛋白質(zhì)定量、上樣過(guò)程中存在的實(shí)驗誤差，保證實(shí)驗結果的準確性。詳細可參考下放內參選擇表：

抗體“疑難雜癥”

1. 一抗，二抗的比例是否重要？

解答：比較重要，調整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底。

2. 做細胞信號傳導，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？

解答：對二抗無(wú)要求，要看你實(shí)驗條件來(lái)選擇，一般推薦用HRP標記的二抗。

3. 同一公司的另外抗體用這個(gè)稀釋度做出來(lái)效果很好，所以沒(méi)做預試，怕費時(shí)間，用什么樣的稀釋度比較好呢？我用的ECL+plus試劑盒顯色。轉膜過(guò)夜，一抗孵育也是過(guò)夜的，若封閉也過(guò)夜的話(huà)就要四天才看的到結果了。

解答：不同抗體，即使是同一公司的抗體，其最佳的抗體稀釋度也是不一樣的，需要你實(shí)驗摸索。我覺(jué)得轉膜過(guò)夜好像沒(méi)有必要吧，轉膜的目的也就是將蛋白轉到膜上就行啦，何必浪費時(shí)間呢。至于具體的轉膜時(shí)間，還要看你的目的蛋白分子量的大??；轉膜的設備，是半干式，還是濕式。一抗當然可以過(guò)夜，如果你想所短Western Blot時(shí)間的話(huà)，可以增高一抗的孵育溫度，我們實(shí)驗室一般37度，兩小時(shí)就足夠了；你可以參照抗體說(shuō)明書(shū)。至于一抗和二抗得稀釋度，你可以一抗1：1500；二抗1：20000試試。另外建議你洗膜時(shí)，多洗幾次，最好是在封閉；一抗和二抗后至少是5x5min，跑一張好膜不容易，多盡點(diǎn)心吧，這樣不會(huì )浪費你的時(shí)間，只會(huì )節省你的時(shí)間！

4. 免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？

解答：免疫組化時(shí)抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱(chēng)表位），有些表位是線(xiàn)性的，而有的屬于構象型；線(xiàn)性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構象型表位由于受蛋白空間結構限制，煮后變性會(huì )消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續的幾個(gè)氨基酸，也就是線(xiàn)性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和Western，而如果抗體識別構象形表位，則只能用于免疫組化。一般抗體說(shuō)明書(shū)上都有注明此種抗體識別的氨基酸區間。（限于單抗）

5. Western Blot 中抗體的重復應用問(wèn)題。

解答：抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用，但是如抗體比較珍貴，可反復使用2－3次。稀釋后應在2－3天內使用，4度保存，避免反復凍融。