DNA純化及雜質(zhì)去除

   酚類(lèi)雜質(zhì)的去除

   對植物中次生產(chǎn)物酚類(lèi)物質(zhì)的去除,普遍是在提取液中加入適量的抗氧化劑和螯合劑,防止多酚氧化褐變。在提取DNA 過(guò)程中加入巰基乙醇、半胱氨酸、二硫蘇糖醇、谷胱甘肽及抗壞血酸等巰基試劑,抑制氧化反應,避免褐化。在樣品液氮研磨及提取緩沖液中加入高分子螯合劑PVP(聚乙烯吡咯烷酮) 或PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮) 等能絡(luò )合多酚和萜類(lèi)物質(zhì)離心或氯仿抽提出去,有效的防止多酚物質(zhì)氧化成醌類(lèi),避免溶液變褐而具有抗氧化作用。因此在提取液中加入適量的PVP 或PVPP 能提高DNA 的純度) ,其用量視雜質(zhì)的多少而定(1 %～6 %) ,PVP 同時(shí)能有效去除多糖。因此將PVP 和巰基乙醇配合使用并調整用量,能夠有效地防止多酚污染。王玉成等認為以上的方法僅對褐化現象較輕者有效,卻很難克服一些含酚類(lèi)化合物豐富的植物,如檉柳、冷杉等樹(shù)種的褐化。在CTAB 緩沖液加入一定量的硼砂(提取緩沖液含0. 012 5 mol/ L 硼砂、2 % CTAB 、 1. 4 mol/ L NaCl 、巰基乙醇0. 1 mol/ L ,pH值為9. 0) 提取檉柳、冷杉的RNA 取得了良好的效果,而且在提取紫丁香、糖槭、旱柳等植物組織的RNA 時(shí)也從未發(fā)生褐化。

    多糖的污染是提取植物DNA 時(shí)常遇到的另一棘手的問(wèn)題 。植物組織中往往富含多糖, 而多糖的許多理化性質(zhì)與DNA 很相似,因此很難將它們分開(kāi)。經(jīng)典的CsCl 梯度離心能有效的除去植物中多糖,但梯度離心設備昂貴,操作不便且DNA 得率很低。近年國內外有一些去除多糖的相關(guān)報道,Dellaporta 等認為加入高濃度的 KAc 有利于除去多糖 ;Fang 等認為在1. 0～2. 5 mol/ L NaCl 的高鹽TE 中,用無(wú)水乙醇沉淀DNA 能除去多糖 ; Sue Porebski 等在沉淀粗提DNA 時(shí),將NaCl 的濃度提高至2. 5 mol/ L 以除去多糖;Candelario 等通過(guò)調節材料的取樣時(shí)期、使用量, 在氯仿處理后加含2 %CTAB 的分離緩沖液, 及延長(cháng)離心時(shí)間等方法來(lái)有效去除仙人掌植物的多糖 ;徐志祥等將DNA 沉淀重懸于30 %乙醇中4 ℃放置過(guò)夜,離心, 上清加乙醇至80 %重新沉淀DNA ,能去除多糖和其他雜質(zhì) ;陳大明等利用活細胞中由于細胞區室化多酚類(lèi)以及其他雜質(zhì)與DNA 相互隔離的特性,在裂解細胞前用不含 CTAB 的提取緩沖液(0. 14 mol/ L 葡萄糖、3 %可溶性PVP、10 mmol/ Lβ2巰基乙醇) 去除細胞質(zhì)中大多數生化成分,同時(shí)有效地防止多酚類(lèi)物質(zhì)被氧化,從而達到排除多酚類(lèi)等雜質(zhì)干擾的目的 ;程運江等先用水飽、乙醚和1. 2～1. 5 mol/ L Na2 Cl 溶液將大部分多糖去除, 再用2 倍乙醇沉淀DNA 可大大提高效率。

    An Michiels 等用生長(cháng)2～4 月的幼苗轉移到暗室暗化處理4 周的黃化葉提取DNA 有效地防止多糖污染,同時(shí)發(fā)現在25 ℃異丙醇過(guò)夜沉淀DNA 能減少雜質(zhì)污染且大大提高產(chǎn)率 。關(guān)于提取DNA 中蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、多酚等各種雜質(zhì)對分子生物學(xué)后續試驗的影響,馬小軍等和文曉鵬等認為在一定范圍內DNA 樣品中蛋白質(zhì)含量的高低, 可能不是影響pcr 擴增的重要因素, 去除RNA 后尚未純化的DNA 作為模板進(jìn)行RAPD 擴增也能得到和純化后一致的條帶。但是, 用EcoRI 和HindIII 檢測表明, 未純化的DNA 不能用于酶切。目前檢測DNA 的純度最常用的方法是測定DNA 在230、260、280 nm的吸收值, 通過(guò)計算OD 260/ OD 280 來(lái)評價(jià)DNA 的純度, 通常認為OD 260/ OD 280 在1. 8～2. 0 表明 DNA 的純度較好。盡管這種方法用得很普遍,但并不可靠, 因為核酸在260 nm處的吸收很強,只有存在高水平蛋白質(zhì)雜質(zhì)時(shí)才會(huì )引起這2 個(gè)波長(cháng)下吸收值的比值發(fā)生明顯改變 。檢測DNA 純度最佳的辦法是采用EcoRI、HindIII 等限制性核酸內切酶對DNA 進(jìn)行酶切消化,只有能被酶切完全并可用作PCR 模板的基因組DNA ,才能證明其純度高,所含蛋白質(zhì)、多糖類(lèi)等雜質(zhì)少,才能進(jìn)一步用于A(yíng)FLP、RFLP、Southern 雜交等分子生物學(xué)的研究。