1.首先是提取大量DNA，由于不同的材料的基因組大小不一樣，故上樣量也不同，但上樣量還是要大一些為好，一般30-50微克左右，若你的DNA質(zhì)量非常好，一般20微克左右就可以，有的材料如獐茅10微克就可以。
注意，上樣量與DNA質(zhì)量，一定要用氯仿異戊醇抽提2遍，在用酚氯仿異戊醇抽提一次。
2. DNA酶切與精致
酶切體系在300-500微升，酶切體系越大切的越完全。
注：體系中先不加酶，在4℃放置4h，其間每隔15min，搖混一次，然后就加半量的酶，消化2h后再加入另一半。
3. 探針標記
嚴格按著(zhù)試劑盒操作進(jìn)行，我們一般用的都是地高辛試劑盒，感覺(jué)很不錯。
注：將lμg制備好的探針用滅菌的ddH2O稀釋至16μl，沸水浴10min變性，之后迅速置冰上冷卻5min。將DIG高效標記試劑充分混合，取4μl加到己變性的DNA混合物中，短暫離心，置于37℃水浴過(guò)夜。用的時(shí)候在變性一次。
4.轉膜：
將跑好的膠進(jìn)行變性1小時(shí)，中和1小時(shí)，然后開(kāi)始轉膜，一般建議采用毛細管轉膜過(guò)夜，我們同時(shí)采用真空轉膜與毛細管轉膜，毛細管效果要好一些！
注：毛細步驟：準備一容器，內裝部分20×SSC，同時(shí)制備一個(gè)支持平臺，平臺上覆蓋以三層濾紙做成的紙橋，紙橋的兩端浸在20×SSC中，注意排除氣泡；
將膠放置在紙橋上，排除氣泡，四周以保鮮膜環(huán)繞以防止SSC直接被紙巾吸收；
剪下略大于凝膠的尼龍膜和濾紙（2張）將其在蒸餾水中浸泡5～10min。
將膜放在膠上，避免產(chǎn)生氣泡，剪與膠一樣大的濾紙三張，用10×SSC 浸濕后放在膜上，同樣避免產(chǎn)生氣泡；
在濾紙上放置5～7cm的吸水紙巾，紙巾上放置一玻璃板和重物，放置過(guò)夜；
去除尼龍膜上面的全部物品，膜與膠一起移走，將膜一側放置在一張干凈的濾紙上，在烘箱中80℃烘干45min或在254nm紫外光下光照5min以固定DNA于膜上。
5.雜交
預雜交：42度預雜交緩慢搖晃1個(gè)小時(shí)，預雜交之前應先將預雜交液預熱到42度。
雜交：將標記好的探針在沸水中變性10min，然后取出迅速放入冰浴中，待冷卻后，將探針加入雜交液(探針終濃度為25ng/ml)，42℃振蕩14～18h。
6.洗膜：
①將雜交后的膜取出，用2×SSC，0.1% SDS在15～25℃漂洗2次，每次5min，漂洗過(guò)程中不停搖動(dòng)；
②然后用用0.5×SSC，0.1% SDS在65～68℃漂洗2次，每次15min，漂洗過(guò)程中不停搖動(dòng)；
③用Washing buffer洗5min，2次；
④將膜放入100ml Blocking solution中溫育30min，漂洗過(guò)程中不停搖動(dòng)；
⑤將膜放入100ml Antibody solution中溫育30min，漂洗過(guò)程中不停搖動(dòng)；
⑥用100ml Washing buffer洗15min，2次，漂洗過(guò)程中不停搖動(dòng)；
⑦用20ml Detection buffer漂洗2～5min。取出尼龍膜用濾紙吸干，加入1ml地高辛化學(xué)發(fā)光底物，用保鮮膜包好，然后在15～25℃放置5min，漂洗過(guò)程中不停搖動(dòng)；
⑧將保鮮膜趕平，在37℃烘箱中放置10min。
注：Blocking solution與Antibody solution一定要先配先用！68度一定要充分洗膜。
7.顯影
①將用保鮮膜包裹的膜放入X光匣中，將DNA面與X光膠片相貼，曝光15～20min；
②在暗室中，取出X光膠片，置顯影液中顯影10min，停影3min，在定影液中定影10min后，用清水沖洗后晾干，觀(guān)察雜交結果。
注，可以同時(shí)放兩張底片，若下面那張背景較重，則上面的一張應該比較適宜！
（本文內轉載丁香通）
