一、組織的取材
注意事項：刀要鋒利、不能用力向下擠壓組織； 組織塊不宜過(guò)大、及時(shí)固定。
二、固定
（一）原則：及時(shí)固定、避免RNA酶的污染4％多聚甲醛（0.1M PBS PH7.4，可加1/1000的DEPC）,動(dòng)物實(shí)驗標 本最好先灌流固定。
（二）固定液的濃度、固定時(shí)間及溫度要適宜
1 濃度越高組織結構保存的越好，但mRNA的保存越差；
2 固定時(shí)間越長(cháng)，mRNA破壞的越多；做原位雜交組織固定時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)，一般24h，不能高溫固定（微波可使組織內溫度升高），低溫可保護RNA不降解（4 ℃冰箱內固定）。
mRNA雜交：最好用冰凍切片
a. 4％多聚甲醛中固定1－2h，浸入15%蔗糖溶液中4℃冰箱過(guò)夜，次日切片或保存在液氮中。
b. 取材后直接液氮冷凍，切片后4％多聚甲醛固定10min，空氣干燥后－70 ℃低溫冰箱保存。
注意：
a. 多聚甲醛與戊二醛混合固定的組織可同時(shí)用作光、電鏡檢查，但不能用于原位雜交實(shí)驗。
b. 石蠟切片蛋白質(zhì)交聯(lián)影響探針穿透，包埋降低mRNA含量
三、玻片和組織切片的處理
玻片的處理：
洗滌：洗滌劑→水洗→洗液（24h）→水洗→雙蒸水洗→60 ℃ 烤干→ 250 ℃烘烤4h，錫箔紙包裹無(wú)塵存放。
玻片硅化：將烘烤過(guò)的載玻片用2％APES丙酮液浸泡3min →用丙酮洗兩次→用DEPC處理過(guò)的蒸餾水洗1～2次→40 ℃烘干→防塵保存待用。（整個(gè)過(guò)程要戴消毒手套進(jìn)行） 未經(jīng)硅化的玻片可以 涂粘附劑（多聚賴(lài)氨酸）
2.增強組織的通透性和核酸探針的穿透性：稀釋的酸洗滌、去垢劑Triton X-100或消化酶（蛋白酶k、胃蛋白酶），用量及孵育時(shí)間視組織的種類(lèi)、固定劑的種類(lèi)及切片的厚薄而定。為保持組織結構，可用4％多聚甲醛再固定。
3.降低背景染色：雜交后的酶處理和雜交后的洗滌。
預雜交：預雜交液不含探針和硫酸葡聚糖，可封閉非特異性雜交點(diǎn)。雜交后用低濃度RNA酶溶液洗滌一次，以減少殘留的內源性RNA。
4.防止RNA酶污染：整個(gè)雜交前處理過(guò)程都需戴消毒手套，所有實(shí)驗用玻璃器皿和鑷子于實(shí)驗前一日200 ℃烘烤。
四、雜交
將雜交液滴于切片的組織上，加蓋硅化的蓋玻片以防止雜交液蒸發(fā)。（放在濕盒中，37 ℃ 孵育）
五、雜交后處理
用不同濃度、不同溫度的鹽溶液漂洗，可有效地減低背景染色，RNA酶液的洗滌可將組織中非堿基配對的RNA除去。
原則：鹽溶液的濃度由高到低，溫度由低到高。
注：切勿使切片干燥。
六、顯示
根據核酸探針標記物的種類(lèi)可進(jìn)行不同顯色處理，原位雜交探針一般是用半抗原地高辛標記的，借助于間接加入的酶（酶標的抗地高辛抗體）使底物顯色，常用的酶有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）。
1.AP顯色系統：－AP+BCIP→BCL-OH+PiBCL-OH+NBT →藍紫色↓
2. HRP顯色系統：－HRP+H2O2 →HRP.H2O2HRP.H2O2 +ODA-NH2 →棕色↓細胞或組織的原位雜交切片顯色后可進(jìn)行半定量檢測，但要注意嚴格控制實(shí)驗條件的同一性，包括切片的厚度、核酸的保存量等。
七、對照實(shí)驗和結果的判斷
對照實(shí)驗的設計須根據核酸探針和靶核苷酸的種類(lèi)以及
現有可能的條件選定：
1.將cDNA或cRNA探針進(jìn)行預雜交（吸收實(shí)驗）。
2.與非特異性序列和不相關(guān)探針雜交（置換實(shí)驗）。
3.將切片用RNA酶或DNA酶進(jìn)行預處理后雜交，應用同義RNA探針進(jìn)行雜交。
4.以不加核酸探針雜交液進(jìn)行雜交（空白實(shí)驗）。
5.組織對照應用已確定為陽(yáng)性或陰性的組織進(jìn)行雜交對照。
6.應用未標記探針做雜交進(jìn)行對照。
八、陽(yáng)性信號的評定
1.陽(yáng)性信號定位于胞漿，藍色細顆粒狀，信號越強顏色越深，陰性對照片中無(wú)陽(yáng)性信號檢出。
2.陽(yáng)性細胞數：陽(yáng)性細胞數≤10％、 ≤ 30％、 ≤70％和>70％分別計為1、2、3和4分。
3.陽(yáng)性著(zhù)色強度：可分為弱、中、強三級，分別計1、2、3分，上述兩種計分相加，1～3分為陰性，4～5分為陽(yáng)性，6～7分為強陽(yáng)性。
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