TAL效應因子（TAL effector, TALE）具有序列特異性結合能力，通過(guò)將FokI核酸酶與一段人造TALE連接起來(lái)，形成了一類(lèi)具有特異性基因組編輯功能的強大工具，即TALEN。利用 TALEN 技術(shù)實(shí)現基因組定點(diǎn)修飾的流程包括以下幾個(gè)步驟。

       第一步，從選定的目標序列中尋找合適的 TALE 候選靶位點(diǎn)，選擇的 DNA 序列 5' 端第一個(gè)堿基最好為 T。

       為了能快速獲得合適的 TALE 候選靶位點(diǎn)，目前已經(jīng)建立了多個(gè)在線(xiàn)軟件：

       (1) https://boglab.plp.iastate.edu；

       (2)http://idtale.kaust.edu.sa；

       (3) http://zifit.partners.org/ZiFiT ;

       (4)http://bloglabx.plp.iastae.edu/TALENT/help.php。

       第二步， 獲取針對 靶 序 列 的 特 異TALE 蛋白。這一步是 TALEN 技術(shù)最為重要和復雜的一步，目前已經(jīng)有多篇文章報道了改進(jìn)后的獲取 TALEN 的方法 [18-22]。

       第三步，選擇合適的 FokI結構域，利用分子生物學(xué)的方法把 TALE 和 FokI組裝在一起構建完整的 TALEN 蛋白。

       第四步，將完整的 TALEN 引入細胞進(jìn)行基因組定點(diǎn)修飾操作。

       第五步，篩選陽(yáng)性克隆，評價(jià)效果。

       以上并不是每個(gè) TALEN 必經(jīng)的步驟，有的會(huì )在第三步與第四步之間加入酵母雙雜交等評估，首先確定其活性，然后再用于實(shí)驗。

實(shí)驗方法：

       根 據TALEN 靶點(diǎn)選擇的原則和文獻的報道，針對 GeneA的第一外顯子設計了一對靶點(diǎn)。先要分別構建出識別左、右半位點(diǎn)的 TALE重復序列載體，再與 pCS2 載體連接，形成最終的表達載體。將 TALE基本單元模塊載體質(zhì)粒轉化至感受態(tài)細胞 TOP 菌種中;大量搖活含有質(zhì)粒的大腸桿菌后，采用天根的質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒;將質(zhì)粒經(jīng)酶切后( SpeI、Nhe I、Hind III)進(jìn)行回收、轉化、連接反應，通過(guò)菌液 PCＲ 篩選出連接成功的質(zhì)粒后，進(jìn)入下一輪反應;經(jīng)過(guò)幾輪酶切、切膠回收及連接反應，直至完成所需要的兩側半位點(diǎn)的 TALE 重復序列，其中每輪的連接后都需要進(jìn)行測序確認;再將 TALE 重復序列與 pCS2 載體連接，構建出最終的 pCS2-TALEN 表達載體質(zhì)粒，酶切檢測片段連接情況后，采用 SP6 測序確認。