凝膠遷移（EMSA）實(shí)驗1
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發(fā)布時(shí)間：2017-11-14
凝膠遷移實(shí)驗有稱(chēng)凝膠阻滯實(shí)驗或電泳遷移率實(shí)驗（EMSA，electrophoretic mobility shift assay），是一種用于蛋白與核算相互作用的技術(shù)。最初是用于轉錄因子與啟動(dòng)子相互作用的驗證性實(shí)驗，也可應用與蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。
一、實(shí)驗原理
EMSA主要基于蛋白-探針復合物在在凝膠電泳過(guò)程中遷移較慢的原理。根據實(shí)驗設計特異性和非特異性探針，當核酸探針與樣本蛋白混合孵育時(shí)，樣本中可以與核酸探針結合的蛋白質(zhì)與探針形成蛋白-探針復合物；這種復合物由于分子量大，在進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)遷移較慢，而沒(méi)有結合蛋白的探針則較快；孵育的樣本在進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉膜后，蛋白-探針復合物會(huì )在膜靠前的位置形成一條帶，說(shuō)明有蛋白與目標探針發(fā)送互作。
二、實(shí)驗操作步驟
1、實(shí)驗前準備
（1）合理的實(shí)驗方案
根據研究目的合理設計特異性探針實(shí)驗組以及非特異性探針對照組，如有必要還可以添加特異性抗體組、特異性核酸競爭組等。
（2）樣本制備
可以選擇提取樣本的總蛋白、核蛋白或者使用純化好的目的蛋白。對樣本蛋白進(jìn)行定量，實(shí)驗中等量加入蛋白。
（3）探針制備
根據實(shí)驗要求設計不同的探針并添加標記，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商業(yè)化的抗體也可以直接購買(mǎi)?，F在大多數實(shí)驗室已經(jīng)不再使用放射性標記，生物素使用相對較多。
2、形成蛋白-探針復合物
（1）在0.5ml離心管中按順序將下列組份混勻：
蛋白樣本（2-5μg） Xμl
poly d(I-C) 1μl
Binding Buffer 2μl
Nuclease-Free ddH2O Xμl
總體積 9μl
（2）冰浴5min后，加入1μ探針。（對照組加1ul對照探針）
（3）PCR儀中室溫（20-23℃）溫育30min。
3、制備凝膠，電泳
（1）制備6.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠：（注意根據試劑情況按比例調整總體積）
5XTBE 1ml
30%Acrylamide/Bis 2.2ml
deionized,sterilewater 6.62ml
80%Glycerol 80μl
10%AP 90μl
TEMED 10μl
總體積 10ml
（2）按標準步驟制備凝膠。
（3）加樣前先在預冷的0.5X TBE buffer中120V預電泳10min，與電泳完畢后沖洗加樣孔。
（4）混合樣本及電泳緩沖液，點(diǎn)樣電泳。
（5）將電泳槽置于冰上或者4℃環(huán)境中，恒壓100V進(jìn)行電泳，直至緩沖液指示帶距離凝膠底部2~3cm為止。（大約50-60min，根據實(shí)際情況調整電泳時(shí)間及電壓；電泳時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)）
4、轉膜
（1）在預冷的0.5XTBE中浸泡凝膠，膜，濾紙和纖維墊。
（2）按如下順序組裝“三明治”：纖維墊，濾紙，凝膠，膜，濾紙，纖維墊。注意電極，確保凝膠位于陰極、膜位于陽(yáng)極。
（3）在預冷的0.5XTBE中進(jìn)行轉膜。轉膜裝置應置于冰上或者低溫室中，恒壓60V轉膜1h。（注意根據實(shí)際情況調整電壓及時(shí)間）。
5、檢測
（1）去除轉好的膜，放入合適的盛有緩沖液的容器中，沖洗。（注意整個(gè)檢測過(guò)程避免膜干燥）
（2）去掉沖洗緩沖液，加入封閉液后輕微震蕩，室溫封閉20min。
（3）加入適量的HRP酶標記的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP conjugate），室溫震蕩孵育45min。（勿將酶標記物直接加到膜上）
（4）去掉酶聯(lián)物稀釋液，用洗滌緩沖液洗膜三次，每次室溫輕微震蕩1 0min。
（5）配置反應底物，均勻加至膜上，室溫孵育5min。（可以在加完底物后，用薄膜輕輕覆蓋在膜上，是底物均勻覆蓋，注意不要產(chǎn)生氣泡）
（6）化學(xué)發(fā)光成像系統曝光成像（曝光時(shí)間的長(cháng)短可以根據檢測方法不同而進(jìn)行相應調整）。（轉帖）
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