質(zhì)粒DNA提取
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發(fā)布時(shí)間：2017-11-15
實(shí)驗方法原理
質(zhì)粒多為一些雙鏈、環(huán)狀的DNA分子，是獨立于細菌染色體之外進(jìn)行復制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒是進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗操作，進(jìn)行遺傳工程改良物種等工作時(shí)最主要的DNA載體。
提取質(zhì)粒的基本步驟分為三步：
①細菌的培養和質(zhì)粒的擴增
②細菌菌體的裂解
③質(zhì)粒DNA的純化
實(shí)驗材料 大腸桿菌
試劑、試劑盒 Tris-Hcl EDTA葡萄糖 NaOHKAacNaAc異丙醇溶菌酶酚:氯仿無(wú)水乙醇LB培養基
儀器、耗材 超凈工作臺培養箱搖床恒溫水浴鍋臺式離心機取液器低溫冰箱冷凍真空干燥機電泳儀水平電泳槽紫外觀(guān)測儀
實(shí)驗步驟
一、材料與試劑準備
1. 材料：大腸桿菌。
2. 儀器：超凈工作臺，培養箱，搖床，恒溫水浴鍋，臺式離心機，取液器一套，低溫冰箱，冷凍真空干燥機，電泳儀，水平電泳槽，紫外觀(guān)測儀。
3. 試劑：
（1）Solution I ：25 mM Tris-Hcl(pH7.4)，10 mM EDTA(pH8.0)，50 mM葡萄糖，高壓滅菌，4℃保存。
（2）Solution II ：0.2 M NaOH， 1%SDS 現配現用。
（3）Solution III ：5 N KAc pH4.8，高壓滅菌，4℃保存。
（4）3 M NaAc pH5.2，高壓滅菌，4℃保存。
（5）異丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，無(wú)水乙醇，70%乙醇，LB培養基，電泳試劑。
二、操作步驟
1. 細菌繁殖：LB培養基，2 ml/20 ml，37℃，200 rpm，搖一搖，過(guò)夜。
2. 離心10 min，5 000 rpm， 4℃；棄上淸液。
3. 沉淀（菌體細胞）預冷的TES緩沖液洗滌，離心10 min，5 000 rpm， 4℃，加入預冷的1 ml Solution I，冰浴10 min。
4. 重新懸浮，加入150 ul溶菌酶母液，室溫放置5 min。
5. 加入1.2 ml Solution II， 冰浴5 min。
6. 加入0.9 ml預冷乙酸鉀，混勻，離心10 min，12 000 rpm，4℃。
7. 加入1.5 ml異丙醇，-20℃冰箱內放置15 min。
8. 離心10 min，12 000 rpm，4℃。
9. 取沉淀，懸于400 ul TE緩沖液中。
10. 加入40 ul，3 M NaAc。
11. 酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀。
12. 離心10 min，12 000 rpm，4℃。
13. 取沉淀，冷凍干燥，再懸浮于50 ul TE緩沖液中。
14. 電泳檢測提取DNA的質(zhì)量。
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