實(shí)驗方法原理
采用粘末端連接必須對目的DNA分子和載體分子進(jìn)行酶切以獲得相應的粘末端進(jìn)行連接。酶切可以是單酶切也可以是雙酶切。單酶切操作比較簡(jiǎn)單，但雙酶切如果兩種酶所用緩沖液成分不同（主要是鹽離子濃度不同）或反應溫度不同，這時(shí)可以采用如下措施解決：1）先用一種酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一種酶切；2）先進(jìn)行低鹽要求的酶酶切，然后添加鹽離子濃度到高鹽的酶反應要求，加入第二種酶進(jìn)行酶切；3）使用通用緩沖液進(jìn)行雙酶切。具體要根據酶的反應要求進(jìn)行，盡量避免星號活力。
實(shí)驗材料 質(zhì)粒DNA
試劑、試劑盒 限制性核酸內切酶蒸餾水
儀器、耗材 微量移液槍離心機電泳儀水浴鍋紫外透射觀(guān)測儀離心管記號筆
實(shí)驗步驟
一、實(shí)驗材料準備
1. 材料：質(zhì)粒DNA。
2. 試劑：限制性?xún)惹忻?、ddH2O。
3 . 儀器：微量移液槍?zhuān)x心機，水浴鍋， 電泳儀，紫外透射觀(guān)測儀。
二、單酶切
1. 在1.5 mL滅菌離心管中依次加入：
（1）質(zhì)粒DNA：X μL（約1 μg）。
（2）限制性?xún)惹忻福? μL（約10 U）。
（3）10×buffer：2 μL。
（4）ddH2O：補足20 μL。
2. 混勻，做好標記。
3. 37℃水浴1-3 h。
4. 70℃水浴10 min中止反應。
5. 電泳檢測酶切效果。
三、雙酶切
1. 在1.5 mL滅菌離心管中依次加入：
（1）質(zhì)粒DNA：X μL（約1 μg）。
（2）限制性?xún)惹忻?：1 μL（約10 U）。
（3）限制性?xún)惹忻?：1 μL（約10 U）
（3）10×buffer：1或2 μL。
（4）ddH2O：補足20 μL。
2. 混勻，做好標記。
3. 37℃水浴1-3 h。
4. 70℃水浴10 min中止反應。
5. 電泳檢測酶切效果。
四、結果與分析
假若一種酶在環(huán)狀質(zhì)粒DNA中只有一個(gè)酶切位點(diǎn)， 且酶切徹底，紫外燈下檢測電泳結果，則單酶切應為一條帶， 而雙酶切則為兩條帶。如果條帶數目多于理論值，那么有可能是酶切不完全。如果酶切結果與酶切前的質(zhì)粒條帶一樣（超螺旋、線(xiàn)性和開(kāi)環(huán)三條帶），則說(shuō)明質(zhì)粒完全沒(méi)有被切開(kāi)。
注意事項
1. 酶切的選擇原則一般是盡量擴大酶切體系，這樣抑制因素得以稀釋?zhuān)换蚪MDNA或質(zhì)粒DNA酶的用量較一般DNA大，一般為1μg/10U；所加酶的體積不能超過(guò)酶切總體積的1/10，否則甘油濃度會(huì )超過(guò)5%，會(huì )產(chǎn)生星號活力；對難切的質(zhì)?；蚧蚪MDNA應延長(cháng)反應時(shí)間4―5hr， 甚至過(guò)夜。滅活限制性?xún)惹忻富钚钥梢圆捎眉訜釡缁?，乙醇沉淀，?氯仿抽提，添加EDTA或SDS等方法，具體每一種酶可能有些方法不能完全滅活，這一點(diǎn)需要注意。
2. 雙酶切體系緩沖液添加量要根據兩種限制性?xún)惹忻缸罴丫彌_體系，可以登錄限制性?xún)惹忻纲徺I(mǎi)公司官方查看。（轉帖）
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