原位雜交技術(shù)應用于染色體、細胞和組織切片等樣品中進(jìn)行核酸特異性檢測，與免疫組化技術(shù)的結合應用，能將DNA、mRNA和蛋白水平上的基因活性與樣品的顯微拓撲信息結合起來(lái)。1969年Pardue和Gall將放射性標記的探針直接應用于純化核酸的雜交，此后得益于分子克隆技術(shù)的發(fā)展，及不同探針標記系統和檢測系統的應用，大大增加了原位雜交檢測的應用靈活性和檢測靈敏度。

 

多種探針標記檢測系統

基于地高辛、生物素和熒光標記分子的標記和檢測系統是常見(jiàn)的原位雜交檢測方法。

熒光標記檢測常為直接探針標記方法，如在dUTP/UTP/ddUTP上連接Fluorescein后進(jìn)行核酸標記。由于標記在核酸上的熒光分子必須經(jīng)受雜交和洗脫過(guò)程中的考驗，以及熒光分子易于衰減，其檢測靈敏度受到一定的影響。但對熒光分子的直接檢測呈現的背景較低。

 

間接標記的方法中應用了報告分子標記的探針，報告分子通過(guò)親和酶促的方法進(jìn)行顯色。常用的報告分子如地高辛，生物素。結合地高辛抗體或鏈霉親和素上耦聯(lián)的酶系統進(jìn)行間接的底物反應檢測。地高辛標記核酸的歷史可追溯到1987年，由于地高辛是洋地黃的花和葉中特有的成分，檢測時(shí)使用的地高辛抗體不會(huì )結合于其他的生物分子。這是相較于生物素標記系統的優(yōu)勢。地高辛抗體上可耦聯(lián)堿性磷酸酶、過(guò)氧化酶，及熒光分子和膠體金等，根據不同的應用需求，呈現高信噪比的核酸檢測結果。但需注意，由于引入了免疫檢測反應，在放大檢測靈敏度的同時(shí)，應注意樣品內源性酶的滅活，以降低檢測背景。

 

通過(guò)不同標記方法的聯(lián)合應用，還可在同一樣本中實(shí)現染色體不同區域或細胞樣本中不同RNA序列的多重檢測。

 

原位雜交中探針的選擇

 

DNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針均能通過(guò)不同的酶促分子反應進(jìn)行標記。寡核苷酸探針的長(cháng)度較短，因此避免了探針內部退火的問(wèn)題，在雜交時(shí)的滲透能力也更好，探針與靶標的接觸這是影響原位雜交是否成功的重要因素之一。DNA探針、RNA探針在合成時(shí)需要控制探針片段長(cháng)度，通常300-1000bp左右，能覆蓋到較長(cháng)片段的靶核酸序列，增加檢測的靈敏度。

就DNA探針和RNA探針的比較，DNA探針在雜交過(guò)程中會(huì )出現探針雙鏈之間退火的可能，也更傾向于在溶液中形成大分子的探針聚合體，從而影響其滲透能力。而RNA 探針的應用，將提高DNA-RNA雜交子的熱穩定性。

Tips：RNA探針因其單鏈、高分子結合力、可適應高溫雜交的特性，其檢測特異性和靈敏度均優(yōu)于DNA探針。常用的RNA探針標記方法為構建質(zhì)粒后進(jìn)行轉率合成。通過(guò)PCR擴增的方法，可以更方便地進(jìn)行RNA探針的制備；RNA探針合成后，還需驗證其對目標片段檢測的靈敏度和特異性。具體實(shí)驗流程和注意事項可參考技術(shù)文章：A Method for High Quality Digoxigenin-Labeled RNA Probes for In Situ Hybridization  

 

 

原位雜交檢測步驟

原位雜交涉及的步驟：玻片的準備和樣品固定，細胞或組織的預滲透處理，靶DNA變性（DNA原位雜交），探針制備，原位雜交過(guò)程，雜交后洗滌，探針（顯色）檢測。

 

1.      玻片的準備和樣品固定

對于染色體涂片，1：1的乙醇/醚處理的載玻片已能符合要求。對于組織切片的原位雜交，為了在實(shí)驗過(guò)程中不丟失組織樣品，可使用多聚賴(lài)氨酸或鉻礬明膠包被的載玻片。

 

樣品的固定步驟是為了保持樣品的原有形態(tài)學(xué)。樣品固定是原位雜交中必不可少的步驟，從化學(xué)反應角度來(lái)看，固定劑的使用和選擇對后續雜交的影響不會(huì )太大，因為核酸雜交的功能分子基團被安全地包裹在DNA雙螺旋結構中，而交聯(lián)劑的使用對RNA基本沒(méi)有影響。對于染色體涂片，常使用甲醇/醋酸溶液固定；石蠟包埋的組織切片用福爾馬林固定。冷凍切片可通過(guò)在4%的甲醛溶液中固定30min，或使用Bouin固定劑。

 

2.      樣品預處理

在待測樣品中，DNA或RNA通常都是被蛋白包裹纏繞，根據不同的細胞和組織樣品的應用，可選擇合適的預處理方法將靶核酸暴露：

 

內源性酶滅活：如果探針的檢測是通過(guò)酶促法進(jìn)行的，則樣品內相應的內源性酶必須被滅活。如內源性的POD可通過(guò)含1% H2O2的甲醛溶液處理30min。如果檢測酶為AP，可在底物溶液中加入左旋咪唑，AP檢測的內源性背景一般來(lái)說(shuō)比POD檢測的低得多，因為在雜交過(guò)程中，樣品中內源性AP酶的活性基本都喪失了。

 

RNase處理：在DNA-DNA雜交實(shí)驗中，RNase的處理可去除內源性RNA，增加實(shí)驗的信噪比。在進(jìn)行mRNA為靶標的檢測時(shí)，RNase處理的樣品也可作為質(zhì)控對照。通常的處理方式是將DNase-free的RNase溶解于2×SSC (100μg/ml)，樣品在溶液中37℃處理60min。

 

SSC=150mM NaCl, 15mM 檸檬酸鈉溶液(pH7.4)

 

HCl處理：對樣本進(jìn)行20-30min的200mM HCl處理，可將蛋白抽提，并將核酸序列進(jìn)行一定程度的水解，增加雜交檢測的信噪比。

 

去垢劑處理：如果對樣品的固定、脫水、包埋等預處理過(guò)程不足以將脂膜成分破壞暴露核酸，可對樣品進(jìn)行額外的蛋白去垢劑處理(如Triton X-100和SDS)。

 

蛋白酶處理：樣品中待雜交的核酸序列常與蛋白纏繞交聯(lián)在一起，樣品的固定步驟更是加劇了蛋白的交聯(lián)程度，因此預滲透是核酸雜交前的常規步驟，通常通過(guò)蛋白酶K的消化作用來(lái)完成。根據不同的文獻來(lái)源，蛋白酶K的工作濃度通常設為10-500μg/ml(溶解于20mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7.4, 酶濃度可根據具體樣品進(jìn)一步優(yōu)化)，對樣品進(jìn)行37°C 7.5 –30min的處理。染色體涂片或核片的蛋白酶K處理濃度可降至1μg/ml消化7.5 min。也有文獻指出，福爾馬林固定石蠟包埋的組織切片樣品，使用胃蛋白酶（500μg/ml，溶于200mM HCl）將得到較好的蛋白消化結果。

 

對于結締組織，肝組織等樣品，還可進(jìn)行Collagenase和Dispase的組織消化處理，以降低背景。

 

3.      探針制備

在進(jìn)行研究前，確定應用的探針類(lèi)型。不同探針類(lèi)型的優(yōu)劣勢請見(jiàn)上文描述。DNA探針的制備包括了前期的DNA片段分離純化（或cDNA的克?。┖兔复偬结槝擞?，可選隨機引物標記法和缺口平移法等。RNA探針的制備包括了轉錄載體克隆和轉錄法探針標記。寡核苷酸探針的制備要求先獲得合成的寡核苷酸片段，再進(jìn)行末端標記或加尾法探針標記。但無(wú)論采用何種標記探針及標記方法，對探針標記效果需進(jìn)行最終的評估，并準確計算探針濃度。

 

4.      原位雜交過(guò)程

雜交前可進(jìn)行預雜交，以防止較高的背景染色。預雜交條件與雜交條件相同，只是預雜交液中不含探針和硫酸葡聚糖（見(jiàn)下）。

 

靶DNA的變性（對mRNA的原位雜交無(wú)需此步）

樣品DNA的變性在DNA-DNA雜交檢測中是必須的步驟，但同時(shí)可能會(huì )造成樣品形態(tài)學(xué)的部分破壞，此步是實(shí)驗中需要優(yōu)化的一個(gè)步驟。常用的變性方法為堿變性和熱變性，實(shí)驗時(shí)可以摸索變性時(shí)間、變性溫度等參數以獲得最佳條件。

如使用熱變性方法，可在雜交時(shí)將探針的變性和樣品DNA變性同步進(jìn)行：將樣品和探針溶液加蓋蓋玻片，置于烘箱80℃變性，染色體DNA樣品處理2min，后冷卻至37℃進(jìn)行雜交。組織樣品DNA的變性時(shí)間可增加至80℃10min。

 

雜交流程

雜交液的成分主要影響了核酸雜交的復性動(dòng)力學(xué)和熱穩定性。雜交液的基礎成分為：Denhardt’s溶液（Ficoll，BSA，PVP），異源核酸（如鯡精子DNA/tRNA/競爭DNA），磷酸鈉，EDTA，SDS，鹽離子，甲酰胺和硫酸葡聚糖，以及雜交探針。不同的應用中進(jìn)行雜交溫度、pH、鹽離子、甲酰胺、探針濃度等條件的優(yōu)化。常用的pH范圍為6.5~7.5，較高的pH值有助于提高雜交的嚴謹性。

 

雜交液中的陽(yáng)離子濃度通過(guò)靜電排斥作用影響了雜交體之間的鏈穩定性，較高的鹽濃度將增加雜交體的穩定性。大于0.4M的Na離子濃度，對Tm值、雙鏈復性速率的影響不大，但隨著(zhù)Na離子濃度的降低，將顯著(zhù)影響Tm值和雙鏈復性速率。

 

有機溶劑（甲酰胺）的作用是降低DNA-DNA和DNA-RNA等雙鏈體的解鏈溫度。通常DNA需要在0.1~0.2M Na+  90~100℃的條件下變性，那么應用于原位雜交，樣品必須在65~75℃的條件下進(jìn)行長(cháng)時(shí)間變性，這將導致樣品形態(tài)學(xué)的破壞。50%甲酰胺的應用能將雜交溫度降至30~45℃。

 

硫酸葡聚糖具有很強的水合性，高濃度的硫酸葡聚糖會(huì )使得核酸分子無(wú)法獲得周邊親水環(huán)境，增加了探針濃度，加快雜交反應速率。

 

雜交常用條件：50% 去離子甲酰胺、2x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 buffer; pH 7.0

1 mM EDTA、載體DNA/RNA (1 mg/ml)、探針(20 - 200 ng/ml)、1x Denhardt’s、5 -10%硫酸葡聚糖、+37 to +42°C下雜交5 min - 16 hours

 

對于短鏈的寡核苷酸探針，具有特殊的雜交動(dòng)力學(xué)和雜交體穩定性，可嘗試從以下雜交條件開(kāi)始優(yōu)化：25% 去離子甲酰胺、4x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 buffer; pH 7.0、1 mM EDTA、載體DNA/RNA (1 mg/ml)、探針(20 - 200 ng/ml)、5xDenhardt’s、+15 to +25°C下雜交2 - 16 hours

 

雜交后的洗滌

雜交后進(jìn)行非特異結合探針的洗脫，同時(shí)也可進(jìn)行單鏈核酸鏈的酶消化。洗脫的嚴謹性可通過(guò)調節洗脫液中的甲酰胺濃度、鹽濃度和洗脫溫度。常規洗滌條件為含50%甲酰胺的2×SSC。但在實(shí)際的實(shí)驗中發(fā)現，對于提高雜交檢測的特異性，嚴謹的雜交條件比嚴謹洗滌更為有效。

 

5.      免疫細胞化學(xué)反應(報告分子標記的探針)

如果使用間接檢測的方法，通常需引入免疫細胞化學(xué)反應進(jìn)行酶免反應和底物檢測。免疫檢測前進(jìn)行樣品的封閉能防止檢測時(shí)的高背景。如進(jìn)行生物素標記的探針雜交和檢測，在含Tween20 和BSA的PBS中進(jìn)行封閉。

 

 如進(jìn)行DIG標記的探針雜交和檢測，在含BlockingReagent的Tris-HCl緩沖液中進(jìn)行封閉。如果抗原抗體的結合能不受高鹽條件影響，檢測時(shí)加入0.4 MNaCl將有助于防止背景染色。封閉后再進(jìn)行抗體孵育反應，通常是在保濕容器中進(jìn)行37°C  30min孵育(或室溫2h孵育)?？贵w結合后在含Tween 20的緩沖液中進(jìn)行3次5–10 min的洗滌。

 

酶反應顯色：使用POD和底物DAB/咪唑構成的顯色系統、AP和底物BCIP/NBT構成的顯色系統；酶免反應的檢測靈敏度提高，成色后色原性物質(zhì)的穩定性和定位功能更好。另外，AP還有一種用于熒光檢測的底物HNPP/FastRed TR, 用于提高熒光檢測的靈敏度。

 

6.      顯微鏡檢測

POD和AP的底物顯色反應后使用普通的顯微鏡鏡檢，且顯色可永久保留。該檢測手段能滿(mǎn)足大部分研究的靈敏度需求。對于樣品厚度較高或密度較大的情況，可使用相差顯微鏡進(jìn)行鏡檢。

 

如使用熒光標記的探針，則在雜交和洗滌步驟后直接用熒光顯微鏡觀(guān)察。熒光探針配合熒光顯微鏡的檢測是進(jìn)行多重探針檢測的良好手段，檢測時(shí)建議使用抗熒光衰減封片劑，以減緩熒光淬滅。DNA復染用的PI或DAPI可直接溶于封片液進(jìn)行染色(40ng DAPI/ml; 100 ng PI/ml) 。

 

原位雜交實(shí)驗文獻參考：A Simplified In Situ Hybridization Protocol Using Non-radioactively Labeled Probes to Detect Abundant and Rare mRNAs on Tissue Sections

 

該文獻對組織切片和FFPE樣品的原位雜交檢測步驟進(jìn)行了詳盡的探索和優(yōu)化，簡(jiǎn)化了實(shí)驗的操作步驟，并能在復雜樣品的雜交實(shí)驗中原位檢測到低拷貝的靶mRNA表達（20~30拷貝/細胞）。