單克隆抗體的制備過(guò)程
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發(fā)布時(shí)間：2016-09-19
單克隆抗體在現代生物醫學(xué)中的作用越來(lái)越大，它不僅被廣泛應用于生化和免疫檢測，而且治療癌癥和自體免疫疾病的單抗藥物也逐漸批準上市。因此單抗的制備和篩選具有其內在的重要性。
動(dòng)物免疫
取4只6周齡雌性BALB/c小鼠皮下注射抗原（20 μg/只），第一次免疫與等量弗氏完全佐劑乳化，0.2 mL/只；兩周后進(jìn)行第二次免疫，抗原與等量弗氏不完全佐劑乳化，皮下注射，0.2 mL/只；兩周后進(jìn)行第三次免疫，免疫方法及劑量同第二次免疫。第三次免疫一周后，小鼠眼眶采血測其效價(jià)，第三次免疫兩周后，選擇效價(jià)最高的小鼠，用不加佐劑的抗原加強免疫，3 d后取小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合。
細胞融合
1 骨髓瘤細胞的準備
選擇生長(cháng)狀態(tài)良好的SP2/0細胞，覆蓋瓶底80％時(shí)棄上清，以不完全培養基洗滌一次后，用l0 mL不完全培養基將細胞輕輕吹下。
2 脾淋巴細胞的準備
取加強免疫后3天的小鼠，摘除眼球采血作為陽(yáng)性血清；頸脫臼將小鼠致死，用75%酒精消毒體表10 min，隨即放入超凈臺內的解剖板上，腹部朝上，四肢固定；無(wú)菌打開(kāi)腹腔取出脾臟，用基礎培養基洗滌，并仔細去掉周?chē)街?zhù)的結締組織；隨后將脾臟轉移到另一個(gè)盛有DMEM的平皿中。用研磨棒擠壓，使脾細胞充分釋放，制成脾細胞懸液。
3 飼養細胞的制備
取一只成熟健康的ICR小鼠，摘眼球采血作為陰性血清，頸脫臼處死；體表消毒和固定后，暴露腹膜，酒精棉球消毒腹膜；用l0 mL注射器，12#針頭，吸取10 mL HAT培養基到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部，抽回腹腔內液體，注入己準備好的容器中。
4 融合
將上述制備的骨髓瘤細胞與脾細胞混合于一支50 mL的帶蓋的融合管中，1000 rpm離心10 min，棄上清。將融合管置于手掌中，輕輕摩擦底部，使兩種細胞充分混勻；在37°C水浴中45 s內緩慢加入1 mL預熱的PEG-1500到融合管中，邊加邊輕輕搖勻；隨即在90 s內先慢后快滴加30 mL 37°C預熱的不完全DMEM培養基，使PEG稀釋而失去作用，37°C靜置10 min，1000 rpm離心10 min；棄上清，用60 mL HAT培養基輕輕懸浮沉淀細胞，再加入適量的腹腔巨噬細胞；分裝于96孔細胞培養板，然后將培養板置37°C 6% CO2培養箱內培養；5 d后用新鮮的HAT培養基換出一半培養基；10 d后用預熱的HT換出HAT；觀(guān)察雜交瘤細胞的生長(cháng)情況，待其細胞培養上清變黃或克隆分布至孔底面積的1/10以上時(shí)，吸取適量細胞上清進(jìn)行ELISA檢測,兩次檢測結果為陽(yáng)性設為陽(yáng)性克隆孔。
雜交瘤細胞的克隆化及建株
采用有限稀釋法對連續兩次檢測為陽(yáng)性的細胞株進(jìn)行克隆化。陽(yáng)性細胞計數，取100個(gè)細胞放入5 mL含飼養細胞的培養液中，即20個(gè)細胞/mL，100 μL/孔滴加于96孔細胞培養板，即每孔1個(gè)細胞：再將余下的細胞懸液倍比稀釋?zhuān)毎麛禐?0 個(gè)/mL，100 μL /孔滴加于96孔細胞培養板，即每孔0.5個(gè)細胞。第8～9 d時(shí)，肉眼可見(jiàn)細胞克隆，對出現單個(gè)細胞克隆的孔再按篩選陽(yáng)性雜交瘤細胞的間接ELISA方法進(jìn)行篩選。連續進(jìn)行三次以上亞克隆，判為陽(yáng)性的細胞株擴大培養，建株凍存。
