做ChIP的心得體會(huì )
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發(fā)布時(shí)間：2016-09-19
做ChIP（Chromatin Immunoprecipitation）已經(jīng)幾個(gè)月了，雖時(shí)間不長(cháng)，但深刻體會(huì )細節決定成敗，這里就把自己認為值得注意的細節總結如下：
1、cell counting：盡量做到準確，會(huì )影響input結果。
2、cross link：甲醛的終濃度是1%，這個(gè)基本所有的protocol上都會(huì )強調。
3、resuspend cells with SDS:一定要選用小的tip頭，在液面下吹打，否則很容易產(chǎn)生氣泡，后面的sonication就麻煩了。
4、sonication：ChIP中最重要的一部分，合適的條件要自己摸索，可以一次嘗試不同次數的sonication，然后建議采用EZ-ChIP上推薦的方法看看sonication的效果如何。
5、加入salmon sperm DNA/Protein A or G之前要先混勻，因為salmon sperm DNA是很粘稠的物質(zhì)，若不混勻，后面你會(huì )發(fā)現beads的量不一樣，自然也會(huì )影響實(shí)驗的結果。
6、wash 的時(shí)候前面幾個(gè)步驟可以不用洗的太干凈，但最后一個(gè)要盡量吸干凈，必要時(shí)可用gel loading tips吸。
7、含beads的samples離心時(shí)，有的protocol上推薦是1000rpm，45秒，但可以根據情況調整，但要注意轉速不能太快防止beads破碎。（當然如果采用的是magnetic的beads就不存在這個(gè)問(wèn)題）
8、reverse crosslink可以是65°4個(gè)小時(shí)，也可以overnight。
9、reverse crosslink后的在進(jìn)行下面步驟之前建議先離心，把蒸發(fā)到離心管蓋子上的部分離下來(lái)。
10、每次行real time PCR之前都要把sample離心保證取樣的準確。
11、1~10ul的槍取3ul以上才比較準確，所以考慮好自己PCR反應體系的配置。
12、一個(gè)ChIP一般需要3~4天的時(shí)間，其中有幾個(gè)步驟是可以停下來(lái)的：
1）細胞收集：用含蛋白酶抑制劑的PBS洗滌離心，去上清的細胞收集液可置-80°凍存；
2）用SDS重懸細胞后可置-80°凍存；
3）sonication結束，離心后的上清置新的離心管后可-80°凍存；
4）reverse cross-link后的標本可-80°凍存。
13、agarose beads 的wash過(guò)程中以及后面的DNA提取過(guò)程中乙醇的wash，可以用細胞室的那種吸引器，接上200ul的tip頭吸，這樣會(huì )節省很多時(shí)間（每個(gè)實(shí)驗室情況可能不一樣）。
14、DNA提取后建議用水溶解DNA，因為T(mén)E buffer里的EDTA可能會(huì )影響PCR反應體系中的Mg2+。
15、溶解DNA的水量可以根據PCR反應體系的要求適當調整。
