質(zhì)粒DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測
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發(fā)布時(shí)間：2016-11-12
一、堿變性法提取質(zhì)粒DNA
質(zhì)粒(Plasmid)是細菌染色體外能自身獨立復制的雙股環(huán)狀DNA。帶有遺傳信息，可賦予細菌某些新的表型。將質(zhì)粒指紋圖譜分析方法、質(zhì)粒 DNA探針技術(shù)及檢測質(zhì)粒的pcr技術(shù)用于臨床感染性疾病的診斷和流行病學(xué)調查已成為現實(shí)。質(zhì)粒作為載體在基因工程中起著(zhù)重要的作用。
分離和純化質(zhì)粒DNA的方法很多,但這些方法基本包括三個(gè)步驟：即細菌的培養和質(zhì)粒DNA的擴增；細菌菌體的裂解;質(zhì)粒DNA的提取與純化。
本實(shí)驗學(xué)習用堿變性方法提取質(zhì)粒DNA 。
【原理】
細菌培養物加入SDS和NaOH堿性溶液處理后，菌體裂解，可使細菌的質(zhì)粒DNA、染色體DNA和RNA一起從細胞內釋放出來(lái)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，因各種核酸分子的遷移率不同將上述核酸分成不同的帶。用溴化乙錠（EB）染色后，在紫外線(xiàn)燈下可看到各種核酸帶發(fā)出的熒光。根據熒光的位置，可區分不同的核酸帶。
【材料】
1、菌株E.coliJM109（pUC19），E.coliRRI（pBR322）
2、試劑溶液Ⅰ(50mM葡萄糖,25mMTris.HclPH8.0,10mMEDTA)
溶液II(0.2NNaOH，1%SDS)用前新配制
溶液III(5mMKAc溶液，PH4.8)
TE緩沖液(10mMTris.Hcl,1mMEDTA，PH8.0)
LB液體培養基(胰蛋白胨10g，酵母粉5g,Nacl10g，加蒸餾水溶解，用NaOH調PH至7.5，加水至1000ml，15磅高壓滅菌15分鐘。)
【方法】
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二、瓊脂糖凝膠電泳
瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)（Agarosegelelectroghoresis）是分離、鑒定和提純DNA片斷的有效方法。凝膠分辨率決定于使用材料的濃度，并由此決定凝膠的孔徑。瓊脂糖凝膠可分辯0.1~6.0kb的雙鏈DNA片段。瓊脂糖凝膠電泳是一個(gè)電場(chǎng)作用。它首先利用瓊脂糖的分子篩效應，此外，在弱堿性條件下，DNA分子帶負電荷，從負極向正極移動(dòng)。根據DNA分子大小、結構及所帶電荷的不同，它們以不同的速率通過(guò)介質(zhì)運動(dòng)而相互分離。借助溴化乙錠（EB）能與雙鏈DNA結合的作用，利用EB染色，并通過(guò)紫外線(xiàn)激發(fā)即可觀(guān)察被分離DNA片段的位置。
【材料】
1、瓊脂糖、10×TAE電泳緩沖液（40mMTris,20mMNaAc,1mMEDTA，PH8.0）
2、載體緩沖液（0.25%溴酚藍，30%甘油）、溴化乙錠水溶液（10mg/ml）
3、凝膠槽、電泳儀
