人非小細胞肺癌裸鼠原位種植轉移模型的建立：（1）探討肺癌遠處轉移和阻斷其遠處轉移的研究；（2）模擬晚期非小細胞肺癌轉移的自然發(fā)生過(guò)程；（3）在活體動(dòng)物的完整器官內評估瘤細胞播散和腫瘤的生長(cháng)。
實(shí)驗方法原理
將表達GFP的質(zhì)粒pRNAT-U6/Neo轉染人肺腺癌細胞A549，G418篩選獲得穩定表達GFP細胞，對比轉染前后細胞的生長(cháng)活性和成瘤性。將轉染后細胞原位種植裸鼠預定標準處死。HE染色和免疫組化檢測轉移灶的位置和數
目。利用KODAK IS2000MM系統檢測腫瘤播散情況。
實(shí)驗材料
BALB c nu nu裸鼠 腺癌細胞株A549
試劑、試劑盒
小牛血清 RPMI-1640培養液 pRNAT-U6 Neo 磷酸鈣 即用型SP超敏 感免疫組化染色試劑盒 DAB Kit 顯色試劑盒 甲醛 EDTA 戊巴比妥鈉
儀器、耗材
熒光顯微鏡 光學(xué)顯微鏡
實(shí)驗步驟
一、實(shí)驗材料準備
1. BALB/c nu/nu裸鼠40只，雄性，4-6周齡，體重18-20 g，無(wú)特定病原體(SPF)級飼養。
2. 肺腺癌細胞株A549，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養基(美國Gibcobrl公司)，5% CO237℃培養，常規傳代。
3. 質(zhì)粒和篩選藥物質(zhì)粒pRNAT-U6/Neo(美國Genscript公司)，攜帶Neomycin耐藥基因供篩選，在CMV啟動(dòng)子控制下編碼cGFP作為轉染標記物。G418(美國Promega公司)800 μg/ml初篩后200 μg/ml維持篩選。
二、細胞的轉染
1. 哺乳動(dòng)物磷酸鈣轉染系統(美國Promega公司)，按照操作指南將質(zhì)粒pRNAT-U6/Neoo轉入A549細胞，轉染后24~48 h熒光顯微鏡下觀(guān)察轉染效率。
2. 后培養液內加G418篩選獲得穩定轉染。
3. 利用平板克隆形成試驗測定細胞克隆形成率>10%后，有限稀釋法獲得表達GFP陽(yáng)性細胞。
4. 1月后收獲轉染細胞，常規傳代培養，培養液中加G418(200 μg/ml)維持篩選。
5. 測定轉染后A549細胞增殖動(dòng)力學(xué)指標，對比轉染前后A549細胞生長(cháng)曲線(xiàn)，檢測轉染后細胞的生長(cháng)活性是否受轉染的影響。
6. 待細胞增殖達一定數量后，裸鼠皮下注射轉染前后細胞，記錄成瘤時(shí)間，用公式V=1/2×長(cháng)×寬 計算腫瘤體積，對比轉染前后兩組裸鼠的瘤體大小以檢測成瘤性是否有差別。
三、人肺腺癌A549裸鼠原位種植模型的建立
1. 取轉染后細胞，用不含血清的RMPI 1640培養液沖洗2次并調整細胞最終濃度為5×106/0.2 ml備用。
2. 用0.5%的戊巴比妥鈉(50 mg/kg)(中國醫藥上?；瘜W(xué)試劑公司)腹腔注射麻醉裸鼠，用26號針頭吸取細胞懸液0.2 ml注射入裸鼠左側胸腔，注射過(guò)程中注意控制刺入針頭的深度。
3. 整個(gè)操作過(guò)程在細胞收獲后半小時(shí)內完成，嚴格遵循無(wú)菌原則。
4. 注射后在KODAK IS2000MM下確認原位種植成功，注射部位為胸腔。
5. 注射后繼續飼養，隔天觀(guān)察一次并記錄體重。
6. 當裸鼠出現精神萎靡、呼吸短促、弓背并明顯消瘦，體重較注射Et減輕20%時(shí)，頸椎脫位術(shù)處死裸鼠。
7. 開(kāi)胸觀(guān)察，取出器官，用10%甲醛固定保存。
四、檢查項目
1. 轉染后細胞熒光顯微鏡成像轉染后24～48 h熒光顯微鏡下觀(guān)察，確認轉染成功。單克隆化過(guò)程中鏡下觀(guān)察細胞克隆生長(cháng)情況。
2. 活體GFP標記成像檢測應用KODAK IS2000MM進(jìn)行活體熒光成像，確認注射部位為胸腔，后間斷應用以活體確認瘤細胞的遠處轉移。
3. 解剖學(xué)與組織學(xué)檢查處死的裸鼠均經(jīng)詳細解剖學(xué)檢查，取出器官、固定包埋后，以4 tun厚度連續切片，切片嚴格編號，奇數號行HE染色，光鏡觀(guān)察，以初步確定轉移灶。
4. 免疫組織化學(xué)染色
選擇肺臟、肝臟和腦作為主要研究器官，在HE染色確定轉移灶位置的基礎上，取相鄰偶數號碼的切片進(jìn)行免疫組化檢測，CEA鼠抗人單克隆抗體(ZM-0062)，LRP鼠抗人單克隆抗體(ZM．0335)工作液，即用型SP超敏感免疫
組化染色試劑盒(sP-9000)、抗原修復液、DAB Kit顯色試劑盒(zU一9032)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。
五、統計學(xué)處理
細胞的生長(cháng)活性和腫瘤體積x±s表示，數值的比較采用方差分析。HE檢測結果和活體成像檢測結果的比較用x2檢驗。采用SPSSl3．0軟件進(jìn)行統計分析。
其他
一、實(shí)驗討論
基于腫瘤生長(cháng)、侵襲和轉移的“種子和土壤”學(xué)說(shuō)，腫瘤細胞在體內的生長(cháng)和播散具有器官特異性。原位種植法模擬肺癌發(fā)生的自然環(huán)境，是建立肺癌轉移模型的最佳方法。腫瘤學(xué)研究中應用最多的皮下種植法建立的模型
只是局部包塊而無(wú)遠處器官的轉移和播散，不出現腫瘤相關(guān)癥狀。McLemom等最早用支氣管內注射的方法在裸鼠右肺內建立了人肺癌原位模型：腫瘤的生長(cháng)較皮下種植法廣泛，但播散僅限于右肺內，未發(fā)展有遠處轉移時(shí)
裸鼠就因肺內病變而死亡，同時(shí)技術(shù)條件要求較高，手術(shù)相關(guān)死亡率高達5%，用來(lái)建立NSCLC轉移模型可行性差。本研究采用胸腔內原位注射法，操作較支氣管內注射法簡(jiǎn)單可行，手術(shù)死亡率低，種植部位為肺內，模擬
臨床NSCLC轉移的自然發(fā)生情形，兼顧實(shí)驗的可行性和可信性，表現出和臨床相像的晚期NSCLC系列癥狀，和臨床相似的肝、腦轉移率，病理解剖過(guò)程中觀(guān)察到的體內播散也和臨床吻合，證實(shí)胸腔內原位注射法適合用于建
立NSCLC轉移模型。
原位種植法建立的模型為體內深部組織生長(cháng)，腫瘤生長(cháng)和播散的檢測和評價(jià)較困難。常規采用每隔幾天處死一定數量裸鼠后行病理分析，來(lái)檢測腫瘤的生長(cháng)和播散，這種方法需要較多裸鼠，而且耗費大量時(shí)間和精力。
KODAK IinageStation 2000MM是KODAK公司運用近紅外成像技術(shù)制造的一套多功能成像系統，它利用內置的紫外epi．illumination(300～400 nm)光源及多達6種不同的濾光片高效率激發(fā)各種熒光標記物。本研究中將攜帶
GFP的質(zhì)粒轉染人人肺腺癌細胞株A549作生物示蹤，細胞生長(cháng)活性和成瘤性均未受轉染的影響，顯像時(shí)無(wú)需注射底物即檢測腫瘤的侵襲和播散。這種檢測方法顯著(zhù)簡(jiǎn)化了上述常規方法，在多個(gè)方面有益于對所建模型的評
價(jià)：①在最初注射時(shí)即可用來(lái)確認注射部位的準確性和注射細胞數量的精確性；②因為種植后產(chǎn)生的轉瘤在數目和體積上有差異，通過(guò)這種體內成像系統能選擇最有代表性的靶病灶；③無(wú)須處死裸鼠即可非侵人性、無(wú)創(chuàng )
性、體外實(shí)時(shí)顯像評價(jià)腫瘤在體內的播散和遠處轉移；④選擇公認的全身嚴重衰竭、呼吸短促、體重減輕20%為裸鼠處死標準，而不是常規的繪制Kaplan—Meier生長(cháng)曲線(xiàn)，應用小數量的裸鼠即可獲得有意義的統計學(xué)結
果，大幅減少了研究人員的工作量。統計學(xué)分析證實(shí)其肝轉移和腦轉移檢測結果與病理檢測結果無(wú)差異，說(shuō)明利用這種方法檢測肺癌遠處轉移結果可信。
胸腔內原位種植法操作簡(jiǎn)便，重現臨床NSCLC轉移過(guò)程；GFP轉入人肺腺癌A549細胞對生長(cháng)活性和致瘤性無(wú)影響，A549/GFP用于NSCLC轉移模型結果可靠；借助于熒光顯像設備，利用GFP的示蹤功能可以非侵人性檢測
NSCLC轉移。
