實(shí)驗方法原理

      活體生物發(fā)光成像技術(shù)的原理：在小型哺乳動(dòng)物體內利用報告基因（熒光素酶基因）表達所產(chǎn)生的熒光素酶蛋白與其小分子底物熒光素在氧、Mg2+ 存在的條件下消耗ATP發(fā)生氧化還原反應，將部分化學(xué)能轉化為可見(jiàn)光能釋放。因此只有在活細胞內才會(huì )發(fā)生發(fā)光現象。并且光的強度與標記細胞的數目線(xiàn)性相關(guān)。

實(shí)驗材料：裸鼠

試劑、試劑盒： DMEM培養基胎牛血清胰酶熒光素底物紫杉醇注射液

儀器、耗材： Kodak多模式活體成像系統ZetePALS型激光動(dòng)態(tài)光散射粒度儀

實(shí)驗步驟

一、材料準備

      1.  動(dòng)物：裸鼠9 只，6～8周齡，雄性；C57小鼠24 只，6～8 周齡，雄性；動(dòng)物均為自由飲水采食。

      2.  細胞：MDA-MB-231人乳腺癌細胞系，使用熒光素酶基因標記。方法：用熒光素酶報告基因標記的質(zhì)粒轉染人乳腺癌細胞， 共轉染的還有選擇性標記基因，從而保證轉染 細胞的穩定性，形成表達熒光素酶的腫瘤細胞株；B16 黑色素瘤細胞。

二、實(shí)驗步驟

      1.  紫杉醇混合膠束的制備

    （1）將適量紫杉醇溶解在少量無(wú)水乙醇和丙二醇的混合溶劑中.

    （2） 加入適當比例的磷脂和表面活性劑A 進(jìn)行充分混合，制得穩定的紫杉醇混合膠束前體制劑，載藥濃度為6 g/L。

    （3）臨用時(shí)按劑量加入生理鹽水中稀釋、搖勻后即可使用。制劑體系的粒徑大小與分布特征采用動(dòng)態(tài)激光光散射粒度儀檢測。

      2.  MDA-MB-231人乳腺癌細胞荷瘤鼠模型的建立

    （1）培養熒光素酶基因標記的MDA-MB-231人乳腺癌細胞系，使用DMEM 培養基（添加 10%胎牛血清），37 ℃、5% CO2 培養箱中培養，每3天傳代1次。

    （2）待細胞密度為80%～90%、細胞總量達到實(shí)驗所需要求時(shí)，使用胰酶消化，收集于PBS溶液重懸。

    （3）如有需要，在細胞培養一定時(shí)間后，應使用抗生素 Zeocin進(jìn)行抗性篩選，  保證熒光素酶基因的表達量足夠。

    （4）收集細胞，使用PBS稀釋至細胞數1.5×108/mL，接種于裸鼠腋下，每只裸鼠的接種量為0.1 mL 。

      3.  動(dòng)物活體成像檢測

    （1）接種后將裸鼠隨機分為3組，分別為生理鹽水組、紫杉醇注射液組、紫杉醇混合膠束制劑組，每組3只。

    （2）腫瘤接種后第8天開(kāi)始給藥，劑量為 15 mg/kg，每3天腹腔注射給藥1次。從第1次給藥開(kāi)始，每7天進(jìn)行1次活體成像檢測。

    （3）采用戊巴比妥對裸鼠進(jìn)行麻醉（劑量為 60~80 mg/kg），  10~15 min 后裸鼠即處于昏迷狀態(tài)。

    （4）腹腔注射熒光素底物（150 mg/kg）， 發(fā)射光波長(cháng)在540~600 nm。注射后15~35 min 觀(guān)測，  為熒光強度最高的時(shí)段。

      4.  活體成像儀參數設置

    （1）將2~3只小鼠并排放入暗室中，熒光素酶與底物反應后產(chǎn)生的發(fā)光不需要激發(fā)，可以自發(fā)光，只需調整CCD相機的曝光時(shí)間拍照即可。

    （2） 選用3 min 曝光時(shí)間，使用軟件Kodak MI In Vivo Fx Pro處理圖像，增加偽彩。

    （3）觀(guān)察腫瘤區域的影像，并根據活體成像圖片測量圖中腫瘤大小，進(jìn)行統計分析。

      5.  在整個(gè)實(shí)驗過(guò)程中，給藥的同時(shí)監測裸鼠體重，采用游標卡尺測量腫瘤大小，運用公式V = π?（6ab2）-1計算腫瘤體積， 繪制腫瘤生長(cháng)曲線(xiàn)，并與活體成像結果進(jìn)行比較，考察紫杉醇制劑的抑瘤效果以及利用活體成像方法評價(jià)藥物抑瘤作用的可行性和準確 性。

      6.  生存周期的測定

    （1）在活體成像實(shí)驗的基礎上，研究不同紫杉醇制劑對B16黑色素瘤C57小鼠的生存期的影響。

    （2）首先培養B16黑色素瘤細胞，以PBS調整細胞數至5×106/mL。采用右后肢皮下注射，每只C57小鼠注射0.1 mL，即細胞數為5×105。

    （3）接種后常溫下正常飲食飼養，于腫瘤接種后第6天，腫瘤直徑達0.2 cm 左右時(shí)，隨機將C57小鼠分成3組，分別為生理鹽水組、Taxol 組、PMM 組，每組8只。

    （4）采取腹腔注射給藥法，每隔3天給藥1次，給藥劑量為15 mg/kg。

    （5）每天觀(guān)察小鼠，以天為單位記錄死亡時(shí)間并繪制生存周期曲線(xiàn)，并計算平均生存周期。

      7.  統計學(xué)方法所有統計的實(shí)驗數據以x ± s表示，采用SPSS軟件對比較的樣本進(jìn)行 t 檢驗。

  （本文轉載丁香園）