實(shí)驗操作流程：

       1、取雙腎，置于冷的PBS中；

       2、去除腎蒂和包膜，在體式顯微鏡下切除腎皮質(zhì)；

       3、將腎皮質(zhì)剪碎，移入EP管中，PBS洗3次；

       4、清洗完畢，沉淀用1g/LⅠ型膠原酶，37℃，30min消化；

       5、加入3倍體積的完全培養基終止消化；

       6、將細胞懸液過(guò)80目篩；

       7、收集懸液，200目篩、1000rpm.離心5min；

       8、沉淀用45％percoll分離液制備25ml懸液；

       9、懸液置于5ml 100%percoll上，14000rpm，4℃，離心25min.;

       10、分層，選擇倒數第二層細胞懸液；

       11、得到近端腎小管上皮細胞，用DF12+10%FBS+雙抗鋪板

注意事項：

       鼠齡要選小一些的，我們一般選2周內的，這樣細胞生長(cháng)活性更好

Q：為什么我取得原代腫瘤組織，分離的卻不是腫瘤細胞？

A：取材時(shí)，我們要熟悉所需組織的類(lèi)型和部位特征，選擇腫瘤細胞集中、活力較好的部分。避免結締等正常組織。

Q：若是細胞中混成纖維細胞，如何去除？

A：成纖維細胞的去除對于腫瘤細胞培養十分重要。由于成纖維細胞貼壁速度較腫瘤細胞快，可利用反復貼壁法使二者分離，進(jìn)而達到清除成纖維細胞的目的。

Q：為什么離心后，沒(méi)有細胞分離出來(lái)？

A：需要考慮消化酶的因素，由于腫瘤組織較致密，胰酶無(wú)法消化，一般選用膠原酶，如膠原酶Ⅳ。若是組織十分致密可以再結合機械法，如研磨或者攪拌加速細胞分散。如下表為二者的區別：

注：膠原酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細胞專(zhuān)用膠原酶，根據分離的組織類(lèi)型需選擇合適的膠原酶類(lèi)型。

Q：消化時(shí)間如何確定？

A：具體的消化酶的量和消化時(shí)間可根據組織類(lèi)型和多少進(jìn)行調整。

Q：消化之前為什么用EDTA?

A：EDTA是一種非酶消化物，又稱(chēng)螯合劑，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好。與細胞上的鈣、鎂離子結合形成螯合物后，形成的機械力可使細胞分散。