拉下實(shí)驗又叫做蛋白質(zhì)體外結合實(shí)驗(binding assay in vitro),是一種在試管中檢測蛋白質(zhì)之間相互作用的方法。
拉下實(shí)驗(Pull-down assay)該實(shí)驗是一個(gè)行之有效的驗證酵母雙雜交系統的體外試驗技術(shù),近年來(lái)越來(lái)越受到廣大學(xué)者的青睞。其基本原理是將靶蛋白-GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹(shù)脂上,作為與目的蛋白親和的支撐物,充當一種“誘餌蛋白”,目的蛋白溶液過(guò)柱,可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白),洗脫結合物后通過(guò)SDS-PAGE電泳分析,從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用或篩選相應的目的蛋白,“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過(guò)細胞裂解物、純化的蛋白、表達系統以及體外轉錄翻譯系統等方法獲得。此方法簡(jiǎn)單易行,操作方便。
實(shí)驗原理
GST融合蛋白沉降技術(shù)利用了GST對谷朧甘膚偶聯(lián)球珠的親和性,從非相互作用蛋白的溶液中純化相互作用蛋白。 GST融合的探針蛋白從細菌中表達和純化,并平行制備細胞裂解液(可被35S標記或非標記),再將GST融合蛋白探針和細胞裂解液在谷朧甘膚瓊脂糖球珠存在下混合并孵育,以使蛋白結合。
GST融合探針蛋白和任何結合分子被離心收集,獲得的混合物經(jīng)洗滌后,用過(guò)量游離的谷朧甘膚洗脫或直接在SDS-PAGE上樣緩沖液中煮沸。蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離后進(jìn)行下一步的western印跡、放射自顯影及蛋白質(zhì)染色分析。GST沉降技術(shù)對探測蛋白在溶液中的相互作用特別有用,而這種相互作用在膜的分析中可能是檢測不到
GST沉降實(shí)驗通常有兩種應用:確定融合(或探針)蛋白與未知(或靶)蛋白間
新的相互作用(Kaelin et al. 1991, Grlinick and Chao 1996),以及證實(shí)探針蛋白與已知蛋白質(zhì)間可疑的相互作用(例子請見(jiàn)Posern et al. 199$, Grgureaich et al. 1999, Hunteret al. 1999, Sun et al. 1999)。這兩種實(shí)驗的設計和實(shí)施都有所不同。
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