雙熒光素酶報告基因實(shí)驗（luciferase Assay）目前由兩個(gè)主要的應用方向：

       第一是檢測轉錄因子與目的基因啟動(dòng)子區DNA相互作用，轉錄因子 是一種具有特殊結構、行使調控基因表達功能的蛋白質(zhì)分子，也稱(chēng)為反式作用因子。某些轉錄因子僅與其靶啟動(dòng)子中的特異順序結合，這些特異性的序列被稱(chēng)為順式 因子，轉錄因子的DNA結合域和順式因子實(shí)現共價(jià)結合，從而對基因的表達起抑制或增強的作用。熒光素酶報告基因實(shí)驗（luciferase Assay） 是檢測這類(lèi)轉錄因子和其靶啟動(dòng)子中的特異順序結合的重要手段

       第二是研究微小RNA(microRNA)對于靶基因的調控，通過(guò)生物信息學(xué)方法預測microRNA潛在的靶基因以及干預位點(diǎn)序列，并設計合適的 microRNA質(zhì)?；蚋深A片段，同時(shí)構建靶基因的報告基因質(zhì)粒，二者同時(shí)轉染細胞，這是確定microRNA是否能影響（上調或下調）靶基因的首選研究 方法。

實(shí)驗原理：

       1）構建一個(gè)將靶啟動(dòng)子的特定片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic（轉錄因子與靶基因）或pMIR-REPORT Luciferase質(zhì)粒（微小RNA與靶基因）

       2） 將要檢測的轉錄因子表達質(zhì)粒（或microRNA質(zhì)粒）與報告基因質(zhì)粒共轉染293細胞或目的細胞。如果此轉錄因子（或microRNA）能夠激活靶啟動(dòng)子，則熒光素酶基因就會(huì )表達，熒光素酶的表達量與轉錄因子的作用強度成正比。

       3） 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應，產(chǎn)生熒光素，通過(guò)檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉錄因子是否能與此靶啟動(dòng)子片段有作用。

  實(shí)驗步驟：

（1） 用生物信息學(xué)方法分析并預測啟動(dòng)子區可能的轉錄因子結合位點(diǎn)。

（2） 設計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動(dòng)子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質(zhì)粒中。

（3） 篩選陽(yáng)性克隆，測序，擴增克隆并提純質(zhì)粒備用。

（4） 擴增轉錄因子質(zhì)粒（或microRNA質(zhì)粒），提純備用，同時(shí)準備相應的空載質(zhì)粒對照。 

（5） 培養293細胞（或其它目的細胞），并接種于6孔板中，生長(cháng)24小時(shí)（80%匯合度）。

（6） 將報告基因質(zhì)粒與轉錄因子表達質(zhì)粒共轉染細胞。

（7） 用適當的方法提取蛋白并用于熒光素酶檢測。

（8） 加入酶作用底物，于熒光計數儀上測定熒光素酶的活性。

（9） 計算相對熒光強度，并與空載對照比較，判斷影響因子是否有效的作用于靶基因。

    （本文轉載丁香通）