我國科學(xué)家應用單細胞遺傳分析儀和拉曼組技術(shù)為抗菌藥效評價(jià)提供新方法
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發(fā)布時(shí)間：2017-03-28
在國家自然科學(xué)基金項目（項目編號：91231205，31327001，31425002）等資助下，中國科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所徐健課題組及其合作者創(chuàng )立了基于重水（D2O）標記單細胞拉曼成像的藥物抗菌效果評價(jià)技術(shù)，實(shí)現了在單個(gè)細菌細胞精度下藥物對細胞代謝活性抑制性的快速精確測量，有可能成為指導臨床精準用藥的新標準之一，研究成果以“Metabolic-Activity-Based Assessment of Antimicrobial Effects by D2O?Labeled Single-Cell Raman Microspectroscopy”（基于重水標記單細胞拉曼成像的抗菌代謝活性檢測）為題于2017年3月10日在線(xiàn)發(fā)表在A(yíng)nalytical Chemistry上。
論文鏈接：http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.analchem.6b05051。
單個(gè)活體細胞是生命的基本單元與進(jìn)化單位。單細胞功能基因組技術(shù)能夠從深度、靈敏度和通量三個(gè)維度來(lái)探索“生命體系的異質(zhì)性機制”等基礎生物學(xué)科學(xué)問(wèn)題以及突破對“尚不可培養微生物”研究的技術(shù)瓶頸。徐健研究員課題組研制的“基于拉曼分選的單細胞遺傳分選儀”已實(shí)現不需標記、基于生化表型的單細胞分選，并針對分選出的單細胞能夠在微流芯片上進(jìn)行集成分析，將現代組學(xué)分析手段深化與拓展到單細胞層面。
目前，在必須使用抗生素治療的臨床案例中，有30%-50%存在治療方案制定、抗生素選擇與療程等方面的錯誤。細菌感染中的抗生素不當使用，一方面可能導致貽誤病情，甚至造成人體菌群紊亂，誘導其它疾病發(fā)生，另一方面還會(huì )加速耐藥菌的出現。因此，準確全面的抗菌效果評價(jià)技術(shù)目前是實(shí)現快速、準確、有效的抗生素用藥的前提和基礎。作為目前微生物藥敏試驗、抗菌藥效評價(jià)和臨床抗菌方案制定的主流標準與主要依據之一，MIC（minimum inhibitory concentration）指數（體外培養細菌24小時(shí)后能抑制培養基內病原菌生長(cháng)的最低藥物濃度）的測量過(guò)程費時(shí)費力，且對實(shí)驗室難以培養或生長(cháng)緩慢的病菌無(wú)法檢測。另外，MIC僅從抑制細菌數目擴增的角度反映與測量藥效，卻不能檢測處于“NGMA”（Non-Growing but Metabolically Active）狀態(tài)（藥物作用下已經(jīng)不再增殖但仍然具備代謝活性）的存活細胞，導致在臨床上仍然可能引起復發(fā)性感染和誘導耐藥菌出現
針對上述抗菌素藥效檢測的瓶頸，徐健研究員課題組應用基于拉曼分選的單細胞分析儀，開(kāi)發(fā)了基于拉曼組（Ramanome）的細菌藥物應激效應成像技術(shù)。徐健研究員與中山大學(xué)光華口腔醫院合作，以導致齲齒的變形鏈球菌（Streptococcus mutants）與多種臨床常用抗菌藥物為模式，研究單細胞拉曼成像精確測量細胞利用胞外重水（D2O）分子的速率，而后者與該細胞的代謝活躍程度呈高度的正相關(guān)。該方法從對微生物代謝活性抑制的角度定量測量藥效，能發(fā)現處于“NGMA”狀態(tài)的細胞。同時(shí)，由于與重水標記耦合的拉曼成像具備單個(gè)細菌細胞的檢測精度，對于大部分細菌、古細菌和真菌，實(shí)現了測量同一樣品內不同細胞之間在藥物抗菌消炎上的差異程度。另外，該方法能夠在30分鐘內快速區分氟耐受型和氟易感型的變形鏈球菌，藥效檢測與評價(jià)的速度顯著(zhù)提高。
基于上述單細胞成像分選與功能分析技術(shù)，徐健研究員及其合作者提出了“基于代謝活性的最低抑菌濃度”（MIC-MA指數）的抗菌藥效指標：藥物作用8個(gè)小時(shí)后所有細胞代謝活性全部并且徹底被抑制的最低藥物劑量。他們發(fā)現，對于特定的病菌和特定的抗菌藥物，MIC-MA指數與MIC指數有顯著(zhù)的不同，如在高達60倍MIC的氨芐西林劑量時(shí)，仍然存在高比例的“NGMA”狀態(tài)變形鏈球菌細胞，有可能發(fā)生抗生素壓力消失時(shí)鏈球菌復發(fā)感染。與目前臨床普遍參照的MIC指數相比，MIC-MA指數有重要特色與優(yōu)勢。
更重要的是，傳統的MIC檢測是將受試微生物作為同質(zhì)化的群體，而忽視了針對細胞之間藥效一致性的考察與評價(jià)，而MIC-MA在單個(gè)細胞精度的藥敏性與藥效檢測，在考察耐藥性形成和細菌微進(jìn)化的機制等生命科學(xué)基礎研究方面具有重要意義。
相關(guān)技術(shù)與方法已申請國家專(zhuān)利四項。（本文轉載國自然基金委員會(huì )）
圖. 基于重水標記單細胞拉曼成像的抗菌代謝活性檢測方法
