當前，microRNA對靶基因的功能研究十分熱門(mén)。利用熒光素酶報告基因檢測實(shí)驗尋找或驗證microRNA對靶點(diǎn)作用性是不可或缺的實(shí)驗技術(shù)。中洪博元可為您提供microRNA報告基因載體構建服務(wù)，并可進(jìn)一步為您提供熒光素酶報告基因檢測實(shí)驗服務(wù)。

您只需要提供目的microRNA靶位點(diǎn)序列，我們專(zhuān)業(yè)的技術(shù)服務(wù)人員就可替您完成載體構建，為您節省大量的時(shí)間和精力。(服務(wù)內容包括：靶位點(diǎn)序列合成、載體構建、細胞轉染、熒光信號檢測和結果分析。

下圖為雙熒光素酶報告基因載體表達框架示意圖，具有多克隆位點(diǎn)，方便插入目的靶點(diǎn)序列。pmirGLO載體包含螢火蟲(chóng)熒光素酶基因和海腎熒光素酶報告基因。

螢火蟲(chóng)熒光素酶報告基因為主要報告基因。若目的基因表達被抑制，則使螢火蟲(chóng)熒光素酶轉錄過(guò)程受阻，抑制螢火蟲(chóng)熒光素酶蛋白翻譯，螢火蟲(chóng)熒光值下降，而作為標準化內參照的海腎熒光素酶的表達不受影響，此時(shí)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性值下降，從而可以確定miRNA與靶基因是否具有直接調控作用。

圖片來(lái)源：中洪博元醫學(xué)實(shí)驗幫

構建雙熒光素酶報告基因實(shí)驗流程：

構建含靶基因3’UTR的雙熒光素酶報告基因載體、microRNA mimics或 microRNA negativecontrol共轉染293T或Hela細胞。共轉染細胞24-72h后，進(jìn)行雙熒光素酶檢測，進(jìn)一步驗確定目的 microRNA的靶基因。

1. microRNA靶點(diǎn)的預測

利用Targetscan,miRDB,PicTar軟件預測靶基因3’UTR與microRNA的結合位點(diǎn)。

2. 構建含靶基因3’UTR的雙熒光素酶報告基因載體

根據軟件預測的靶基因3’UTR與microRNA的結合位點(diǎn)，設計引物PCR擴增靶基因3’UTR序列，或直接進(jìn)行基因合成，再插入到雙熒光素酶報告基因載體上。

3.microRNA mimics和 microRNA negativecontrol的合成

      合成相應的microRNA mimics和 microRNA negativecontrol.

      4.細胞轉染準備

      將靶基因3’UTR的雙熒光素酶報告基因載體和microRNA mimics或microRNA negativecontrol共轉染293T或Hela細胞。

      5.熒光素酶檢測

      共轉染細胞24-72h后，進(jìn)行雙熒光素酶檢測，確定目的microRNA的靶基因。

整理分析數據，得出結論：

      提供有含靶基因3’UTR的雙熒光素酶報告基因載體甘油保存菌株一支，microRNA mimics和 microRNA negativecontrol各一只。

附相應的載體的說(shuō)明書(shū)以及實(shí)驗報告：

包括載體構建過(guò)程，載體鑒定記錄，測序報告，細胞轉染，熒光檢測，圖表輸出和結果分析。