分子克隆實(shí)驗中還有有關(guān)質(zhì)粒的問(wèn)題是實(shí)驗研究的必備技能之一。今天中洪君與大家就好好說(shuō)道說(shuō)道質(zhì)粒的轉化——

質(zhì)粒轉化原理

質(zhì)粒的轉化是指將質(zhì)?；蛞运鼮檩d體構建的重組子導入細菌的過(guò)程。將連接產(chǎn)物轉化到感受態(tài)細胞中，實(shí)現重組克隆的增殖，便于后續分子操作?？梢圆捎枚喾N方法篩選和鑒定目的克隆。實(shí)驗目的是掌握熱激法或電轉化法轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞及轉化子的鑒定方法。

質(zhì)粒常規轉化實(shí)驗方法與步驟

1、取一個(gè)1.5ml離心管，加入50μl感受態(tài)細胞懸液，置冰上。加入50-100ug質(zhì)粒，用移液器輕柔混勻。冰上靜置20min。

2、將EP管先放于42℃水浴中熱激30-40秒，然后迅速置冰上3~5min。整個(gè)過(guò)程不要振蕩菌液。

3、加入500ul LB液體培養基(一定不含抗生素)，混勻后37℃振蕩培養(180rpm)1小時(shí)，使細菌恢復正常生長(cháng)狀態(tài)，并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因。

4、制備含有Amp抗生素的LB平板。

5、取100ul菌液，將液體滴加至含有抗生素Amp的LB固體培養基平板上，用三角玻璃棒均勻涂抹。

6、37℃培養箱內正置15分鐘， 待菌液被培養基吸收后，37℃倒置培養12~16小時(shí)，次日可見(jiàn)均勻分布的陽(yáng)性克隆。挑取單克隆菌落后，送公司測序，驗證是否為陽(yáng)性篩選質(zhì)粒?；蛘咧苯犹羧【浜?，加至含有抗生素的液體LB肉湯中搖菌，獲得大量菌液后提取質(zhì)粒。

目前市面上也有一些快速轉化感受態(tài)細胞。轉化過(guò)程不需要冰浴、熱敷和孵育等步驟，比如有些感受態(tài)細胞實(shí)現了五分鐘轉化：

1.  取一個(gè)1.5ml離心管，加入50μl感受態(tài)細胞懸液，置冰上2分鐘。

2.  42度熱激30s。

3.  置冰上2分鐘。

4.  加入200ulLB液體培養基后，均勻涂抹于37度預熱的抗生素LB固體平板。注意，此時(shí)LB固體平板一定要先放于37度培養箱中預熱。

注意事項：

1. 感受態(tài)可用滅菌的離心管分裝使用。

      2. 根據需要在第5步驟時(shí)將轉化液6000rpm離心3min，然后只留下100μl左右的上清液，混勻沉淀，全部加入相對應的平板中。

3. 轉化過(guò)程在超凈工作臺中進(jìn)行。

轉化失敗案例解答：

Q：我們做了轉化，1ul的質(zhì)粒加入4ulM水，取1.5ul進(jìn)入感受態(tài)細胞，1mlLB培養基，涂了2個(gè)板子，結果沒(méi)長(cháng)一個(gè)菌，應該是能長(cháng)出來(lái)了，步驟的話(huà)就是加入感受態(tài)后冰浴30min多冰了5min，熱激后冰浴5min又多冰了3、4min,然后就沒(méi)有什么地方出錯了，質(zhì)粒是別的實(shí)驗室寄過(guò)來(lái)的，好的。不知道啥原因，請教下轉化失敗的可能原因有哪些？

這一批感受態(tài)還不錯，有人做了別的挺好，熱激很注意的，沒(méi)問(wèn)題，是熱激后迅速冷卻那兒冰久了點(diǎn) ，無(wú)抗的LB復蘇了50min，糾結啊~

      A：質(zhì)粒轉化一般是沒(méi)啥問(wèn)題的。但是結果你杯具了。

我總結幾個(gè)原因：

1.熱擊標準時(shí)間是60-90s，你注意下你是不是熱擊超時(shí)；

2.感受態(tài)細胞的問(wèn)題，感受態(tài)是否保存時(shí)間過(guò)長(cháng)效率降低；同時(shí)，感受態(tài)最高的轉化效率在解凍的短時(shí)間內。你要注意你是否沒(méi)有在解凍的短時(shí)間內加入需轉化質(zhì)粒；

3.質(zhì)?？剐栽?，要搞清楚你的質(zhì)粒是什么抗性，是amp還是kana？涂錯了板子你就徹底杯具了；

4.有的感受態(tài)不是很猛，你轉化進(jìn)去的質(zhì)粒不能很快使細菌表現出抗性。你迅速涂板子，你就杯具了。有時(shí)候要用無(wú)抗的LB培養基復蘇一下細菌，一般30-60min。