RNA-Seq技術(shù)，一直在進(jìn)步
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發(fā)布時(shí)間：2017-09-15
2009年，耶魯大學(xué)的科學(xué)家如此評價(jià)RNA測序：這些使用RNA-Seq的研究已改變了我們對真核轉錄組復雜程度的看法。RNA-Seq能夠比其他方法更準確地測量轉錄本及其他異構體的水平。如今，分子生物學(xué)家已將RNA-Seq視為探索RNA的最靈敏方法。
在RNA-Seq出現之前，科學(xué)家往往采用芯片來(lái)分析轉錄本?！八嬖诒尘昂徒徊骐s交的問(wèn)題，并且不能檢測重復序列的RNA轉錄本，”NEB的應用科學(xué)家Daniela Munafo解釋說(shuō)。此外，芯片只能測定已知的RNA轉錄本的相對豐度，無(wú)法檢測極微小的基因表達水平改變，而這對于了解生物反應至關(guān)重要。
相比之下，RNA-Seq具有很多優(yōu)勢。它能以單堿基分辨率測定特定基因的表達水平，了解等位基因特異性表達、選擇性剪接、RNA編輯等等。RNA-Seq讀取轉錄組序列的能力也讓以前未研究過(guò)的新事件或新物種得以鑒定，而無(wú)需背景知識。
聚焦單個(gè)細胞
細胞分離技術(shù)的進(jìn)步讓RNA-Seq開(kāi)始應用在單個(gè)細胞上，而不再是一大塊樣本 。NEB的開(kāi)發(fā)科學(xué)家Keerthana Krishnan認為：“單細胞或細胞亞群的高分辨率測序可揭示樣本的復雜性。對疾病進(jìn)展的模型而言，這有助于確定突變來(lái)源的細胞?！?/span>
在被問(wèn)及單細胞RNA-Seq的主要應用時(shí)，Bio-Rad的高級產(chǎn)品經(jīng)理Dan Norton指出：“盡管它的應用領(lǐng)域非常廣泛，但免疫學(xué)一直是一個(gè)巨大的推動(dòng)力。這主要是因為，相對于實(shí)體組織的原代細胞而言，免疫細胞更容易獲得和分析。從自身免疫性疾病到免疫腫瘤學(xué)，研究人員正在研究免疫系統自身的疾病，以及如何利用免疫系統來(lái)對付其他疾病?！?/span>
發(fā)育生物學(xué)是另一個(gè)主要的應用領(lǐng)域。Norton指出，它的應用范圍包括利用干細胞來(lái)重現正常的身體過(guò)程、疾病狀態(tài)和器官，以及了解細胞分化的關(guān)鍵發(fā)育階段。
組織和腫瘤鑒定也一直受到關(guān)注?！巴ㄟ^(guò)研究樣本中的細胞分類(lèi)，研究人員可以回答一些問(wèn)題，比如哪些群體存在，它們如何隨著(zhù)特定疾病而改變，以及如何鑒定一般的細胞群體，”Norton說(shuō)?！敖M織鑒定是全方位的，從胰島到肝臟、心臟和腫瘤活檢?！?/span>
通過(guò)研究單細胞中的RNA，“你可以看到組織內的某些細胞存在哪些轉錄本，有哪些不同的細胞類(lèi)型，以及它們如何隨著(zhù)時(shí)間或條件而變化，”Norton解釋道?！熬科浔举|(zhì)，單細胞測序提供了重要的分辨率?！?/span>
在某些情況下，比如癌癥，研究人員希望鑒定極其罕見(jiàn)的細胞群體，因為它們在克隆演化中起了重要的作用，但達到這一檢測水平卻不一定實(shí)際?！盀榱藱z測極其罕見(jiàn)的細胞群體，人們需要讓測序達到一定的深度，這不太經(jīng)濟，”Norton說(shuō)。
當然，獲取單細胞的方法也是一個(gè)絆腳石。Norton認為，目前并沒(méi)有一個(gè)解離組織的標準方案，往往要犧牲細胞活力，或因細胞應激而引起轉錄組的變化。因此，盡管單細胞RNA-Seq帶來(lái)巨大希望，但一些技術(shù)上的改進(jìn)有望使其更進(jìn)一步。
降低拼圖的難度
如今，科學(xué)家都想測序更長(cháng)片段的DNA，以便更好地觀(guān)察完整的圖像。這就好像100塊的拼圖和1000塊的拼圖，難度根本就不是一個(gè)級別嘛。RNA-Seq也是如此。人們已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一些方法。
據Pacific Biosciences的農業(yè)應用總監Emily Hatas介紹，PacBio已開(kāi)發(fā)出全長(cháng)轉錄本測序方法Iso-Seq，采用的是長(cháng)讀長(cháng)的單分子實(shí)時(shí)測序（SMRT）技術(shù)。短讀長(cháng)的測序方法會(huì )打斷轉錄本，開(kāi)展測序，然后利用生物信息學(xué)將數據拼在一起?！斑@個(gè)組裝的過(guò)程特別容易出錯，特別是在確定轉錄的起始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)時(shí)，”Hatas說(shuō)。
利用Iso-Seq方法，一個(gè)與PacBio合作的研究小組表明，雞的轉錄組在復雜性上與人類(lèi)不相上下。在過(guò)去的嘗試中，研究人員表示很難從短讀長(cháng)的RNA-Seq數據中鑒定轉錄本。有了長(cháng)的序列，可變轉錄事件的相對比例說(shuō)明了雞和人類(lèi)轉錄組的相似之處，同時(shí)也解釋了之前觀(guān)察到的基因組差異。
近日，四川農業(yè)大學(xué)的團隊也利用這種方法來(lái)解析家兔的轉錄組。他們的分析證明了“通過(guò)PacBio測序得到的轉錄本，在10個(gè)MHC基因中重建高度同源序列的能力明顯高于來(lái)自短讀長(cháng)組裝的轉錄本數據”。而“短讀長(cháng)通過(guò)de novo組裝，往往容易得到片段化或是混亂的轉錄本”。
深入挖掘數據
無(wú)論RNA-Seq本身有什么進(jìn)展，數據分析將仍是關(guān)鍵的一步。它涉及到聚類(lèi)，從字面上講是將相似事物的數據分組，如轉錄本。舉個(gè)例子，人們可以將同一種癌癥的患者轉錄本數據分組。
一些科學(xué)家將RNA-Seq的樣本聚類(lèi)應用到癌癥數據上?！拔覀兊脑u估考察了表達評估、非特異篩選后的基因數量和數據轉換的策略，”他們總結道?！敖Y果表明，基于基因定量的癌癥樣本聚類(lèi)應優(yōu)先考慮?！?/span>
RNA-Seq的結果取決于樣本采集和制備，測序方法和平臺，以及分析數據的計算方法。各個(gè)方面的選擇都在不斷增加。分子生物學(xué)家深信利用RNA-Seq可以解決更多的難題，因為一切才剛剛開(kāi)始。
（本文轉載生物通）
