如何選擇合適的熒光蛋白
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發(fā)布時(shí)間:2017-11-23
自 1992 年綠色熒光蛋白被用于標記基因,各種顏色的熒光蛋白被開(kāi)發(fā)出,目前有上百種的熒光蛋白。
在我們的實(shí)驗中,經(jīng)常會(huì )用到熒光蛋白,但是如何選擇合適熒光蛋白,得到完美的實(shí)驗結果?相信這個(gè)問(wèn)題一直困擾著(zhù)大家,鑒于此,小編從不同的角度去考慮如何選擇熒光蛋白,希望可以給大家在選擇熒光蛋白方面提供一些幫助。
Tubes of various fluorescent proteins displayed in a box with UV light shining on them.
單體性質(zhì)
將熒光蛋白與目標蛋白進(jìn)行融合表達,直接地追蹤目標蛋白或是定位目標蛋白,這就要求熒光蛋白是單體,不能影響目標蛋白的功能和定位。因此,我們將熒光蛋白的單體性質(zhì)放在第一位。
目前體外檢測熒光蛋白單體性質(zhì)的方法有分子篩、沉降平衡,可以通過(guò)熒光蛋白分子篩的峰圖是否狹窄,單一粗略的判斷其是否為單體,沉降平衡能夠更加準確的確認其聚合性質(zhì)。我們使用熒光蛋白幾乎都是在細胞內或組織內,因此我們更加關(guān)心在生理條件下,熒光蛋白的聚合性質(zhì)。
科學(xué)家巧妙地將熒光蛋白與細胞色素 P450 進(jìn)行融合表達,讓熒光蛋白定位在內質(zhì)網(wǎng)的胞質(zhì)面,熒光蛋白的聚合性質(zhì)會(huì )使鄰近的熒光蛋白聚合在一起,形成聚集體,在激光共聚焦顯微鏡下能夠看到細胞核的周?chē)泻艽蟮狞c(diǎn)狀結構。小編已經(jīng)用此種方法檢測了多個(gè)熒光蛋白。
The structure of mEos2
小編發(fā)現綠色熒光蛋白中,單體性質(zhì)比較好的是 mEmerald,該蛋白很少形成大的點(diǎn)狀結構,并且目前還沒(méi)有稱(chēng)該蛋白會(huì )影響定位的報道。
此外 mEmerald 是一個(gè)非常穩定的綠色熒光蛋白,因此可以用于線(xiàn)性的結構光照明超分辨熒光顯微成像。
我們還發(fā)現紅色熒光蛋白中沒(méi)有一個(gè)單體性質(zhì)特別好,相比較來(lái)說(shuō),mApple 的單體性質(zhì)最好,但是在使用該蛋白的過(guò)程中,發(fā)現 mAppple 會(huì )影響某些蛋白的定位,因此在使用紅色熒光蛋白時(shí),要謹記紅色熒光蛋白可能會(huì )影響目標蛋白的定位。
PK 值
每個(gè)熒光蛋白都有其最合適的 pH 值,即在一定的 pH 值下,熒光強度最高。有的熒光蛋白適合在酸性環(huán)境下使用,相反有的適合在堿性環(huán)境下使用,因此在選擇熒光蛋白時(shí)需要考慮熒光蛋白的 PK 值。
Change in relative fluorescence intensity(RFU)with pH for eGFP(grey triangles)and bfloGFPa1(black squares)
在細胞內,大多數細胞器內及細胞質(zhì)的 pH 值都在 7.0 左右,然而溶酶體內的 pH 值就比較低,因此常規的熒光蛋白并不適合用于標記溶酶體內的蛋白。
mCherry 的 PK 值比較低,適合在酸性的環(huán)境下使用,可以用于標記溶酶體內的蛋白,但是該熒光蛋白有一定的二聚性質(zhì),可能會(huì )影響目標蛋白的定位,在使用該熒光蛋白時(shí)要綜合考慮單體性質(zhì)和 PK 值。
在選擇熒光蛋白時(shí),要考慮目標蛋白定位環(huán)境的 pH 值,再考慮使用相應 PK 值的熒光蛋白。同時(shí)也可以考慮利用熒光蛋白的 PK 值的特性,幫助我們解決問(wèn)題。
成熟時(shí)間
熒光蛋白在發(fā)光之前需要經(jīng)歷轉錄、翻譯、折疊等步驟,其中折疊過(guò)程占據了大部分時(shí)間,我們將此過(guò)程稱(chēng)之為成熟時(shí)間。在標記短壽命的目標蛋白時(shí),如果熒光蛋白的成熟時(shí)間太長(cháng),可能會(huì )出現在目標蛋白開(kāi)始降解時(shí),熒光蛋白還沒(méi)有發(fā)光,導致無(wú)法追蹤及定位目標蛋白。因此在選擇熒光蛋白時(shí),需要考慮其成熟時(shí)間。
小編在實(shí)驗時(shí)發(fā)現,mEmerald、Dendra2 的成熟時(shí)間比較快,在用 Lipo2000 轉染試劑盒轉染 U2OS 細胞時(shí),轉染后四個(gè)小時(shí)就能夠用熒光顯微鏡觀(guān)察到了熒光信號,EGFP 沒(méi)有信號。但是在用 P450 方法檢測時(shí),Dendra2 會(huì )形成很大的聚集,表明該熒光蛋白的單體性質(zhì)不好,有可能影響目標蛋白的定位和功能,在使用該蛋白的過(guò)程中應該注意這個(gè)特性。
為了能夠更早地觀(guān)察某些短壽命熒光蛋白的生理特性和定位情況,科學(xué)家正在發(fā)展成熟時(shí)間更快的熒光蛋白,并且用于超分辨成像。
光穩定性
熒光蛋白在發(fā)光的同時(shí)會(huì )被漂白,逐漸失去發(fā)光能力,因此要想獲得更多的信息,就需要熒光的光穩定性好。在普通的熒光成像中,對熒光蛋白的光穩定性要求并不是很高,比如激光共聚焦顯微鏡成像時(shí),熒光信號的穩定性只需要能保證采集的完整的一張圖即可。
在超分辨熒光成像中,對熒光蛋白的光穩定性要求比較高。線(xiàn)性結構光照明顯微鏡要求熒光蛋白始終處于亮的狀態(tài),需要通過(guò)結構光采集多幅圖進(jìn)行重構;非線(xiàn)性結構光顯微鏡則要求熒光蛋白在黑亮之間進(jìn)行多次切換,這就要求熒光蛋白能進(jìn)行反復的光調控,并且依舊維持著(zhù)高的亮度;與非線(xiàn)性結構光顯微鏡一樣,可逆飽和光線(xiàn)性熒光轉移顯微鏡也要求熒光蛋白能夠在黑亮之間進(jìn)行反復的光調控。
優(yōu)化密碼子
大多數熒光蛋白是來(lái)自于海洋生物,因此密碼子偏好性與所要標記蛋白的物種有較大的差異,這種密碼子偏好性差異可能會(huì )導致熒光蛋白在哺乳動(dòng)物細胞或組織中的表達量極低,以至于看不到熒光信號。
幸運的是大多數熒光蛋白的密碼子已經(jīng)經(jīng)過(guò)優(yōu)化,適合在哺乳動(dòng)物細胞中進(jìn)行融合表達。但是當需要使用熒光蛋白在其他種屬細胞內表達時(shí),應考慮一下密碼子偏好性。
小編在進(jìn)行線(xiàn)蟲(chóng)熒光成像時(shí),就遇到過(guò)此類(lèi)問(wèn)題,沒(méi)有優(yōu)化密碼子時(shí),熒光蛋白的表達量比較弱,在熒光蛋白經(jīng)過(guò)密碼密碼子優(yōu)化,并且在 DNA 序列之間插入線(xiàn)蟲(chóng)的內含子后,熒光蛋白的表達量得到了較大的提高。
在比較少見(jiàn)的物種進(jìn)行熒光成像時(shí),需要把密碼子優(yōu)化這個(gè)特性考慮在內。
N 端或 C 端
在選擇了相應的熒光蛋白后,我們需要確定把目標蛋白放在熒光蛋白的 N 端或是 C 端。N 端與 C 端的區別在于目的蛋白,有的目的蛋白對這個(gè)要求不高,但某些目的蛋白就要求在特定的位置進(jìn)行融合表達。
熒光蛋白與目的蛋白融合表達可能會(huì )影響目的蛋白的折疊,這取決于目的蛋白折疊過(guò)程中,熒光蛋白所在的那一端有沒(méi)有參與蛋白質(zhì)的折疊。
例如,如果目的蛋白的 C 端會(huì )被折疊入目的蛋白的內側,那么我們把熒光蛋白標記在目的蛋白的 C 端,將獲得不到熒光信號;有些目的蛋白在后翻譯的過(guò)程會(huì )切掉一段,如果熒光蛋白處于被切的一端,那么就不能獲得準確的目的蛋白的定位信息。
如果標記的目的蛋白是一個(gè)新的蛋白,我們建議分別進(jìn)行 N 端和 C 端融合表達,以此來(lái)確定哪一個(gè)是最好的選擇。除此之外,還可以用免疫熒光來(lái)確認目的蛋白定位是否與熒光蛋白融合表達的一致。
綜合以上的介紹,在我們選擇熒光蛋白時(shí),首要考慮的是熒光蛋白的聚合性質(zhì),即是否會(huì )影響目的蛋白的功能及定位,其次是熒光蛋白的 PK 值是否與目的蛋白所處的環(huán)境的 pH 值相匹配,然后是熒光蛋白的成熟時(shí)間以及目的蛋白的壽命,綜合兩者決定熒光蛋白是否合適,最后考慮熒光蛋白的光穩定性、密碼子偏好性是否合適,最后考慮目的蛋白放的位置,熒光蛋白是否會(huì )影響目的蛋白的功能及定位。
此外,在進(jìn)行熒光成像時(shí),需要考慮顯微鏡所選的濾光片是否與相應的熒光蛋白質(zhì)配套,顯微鏡的各種參數是否合適。值得提醒的是,激發(fā)光的強度不能太高,否則會(huì )導致熒光信號的漂白。
(本文轉載丁香通)