腫瘤細胞免疫治療在腫瘤患者術(shù)后復發(fā)預防和全身多處微轉移灶清除中發(fā)揮重要作用。PET顯像作為一種核素標記示蹤的分子影像技術(shù)，能夠對體內的過(guò)繼免疫細胞進(jìn)行遷移定位、腫瘤靶向、數量擴增、細胞活化及免疫功能發(fā)揮等多方位的動(dòng)態(tài)連續監測，從而對腫瘤細胞免疫治療進(jìn)行臨床指導和療效評估。腫瘤細胞免疫治療的PET顯像研究經(jīng)歷了免疫細胞體外直接放射性核素標記、免疫細胞體內報告基因間接放射性核素標記和免疫細胞體內內源性分子直接放射性核素標記3個(gè)階段。本文著(zhù)重闡述PET報告基因顯像這一階段，探討相關(guān)研究進(jìn)展及面臨的問(wèn)題和挑戰，從而為日后腫瘤細胞免疫治療PET報告基因顯像的基礎研究和臨床研究提供新方向和新思路。

1.腫瘤細胞免疫治療的PET報告基因顯像

對于腫瘤細胞免疫治療的在體可視化核素顯像監測，最早采用的方法是將免疫細胞預先進(jìn)行體外放射性核素直接標記，然后將標記后的細胞回輸到體內，最后進(jìn)行核素顯像。但是核素的自我衰變、標記核素的在體代謝清除以及標記免疫細胞的在體擴增，均可導致核素探針在體劑量的極速衰減，從而無(wú)法實(shí)現腫瘤細胞免疫治療的長(cháng)期動(dòng)態(tài)可視化監測。此外，體外標記過(guò)程中所使用的大劑量放射性核素也會(huì )對免疫細胞的狀態(tài)和功能造成一定的影響，并最終影響其在體內的抗腫瘤免疫活性。這在很大程度上影響和限制了免疫細胞的體外直接標記PET顯像技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和應用。

免疫細胞的PET報告基因顯像，能夠克服直接標記技術(shù)的眾多不足，從而實(shí)現腫瘤細胞免疫治療的全身、無(wú)創(chuàng )、長(cháng)期、連續動(dòng)態(tài)監測。首先，在體外通過(guò)基因工程學(xué)技術(shù)，使治療用免疫細胞及其子代細胞穩定表達PET報告基因相關(guān)蛋白，然后將這些基因修飾后的免疫細胞回輸到腫瘤患者體內，選擇合適的時(shí)間點(diǎn)，向機體內輸注核素標記的PET報告基因探針，通過(guò)與報告基因相關(guān)蛋白特異性結合，實(shí)現核素標記探針在免疫細胞表面或胞內的特異性富集，最終通過(guò)PET顯像實(shí)現免疫細胞的在體可視化成像。

根據報告基因相關(guān)蛋白與報告基因探針之間相互作用方式的不同，可將報告基因分為酶類(lèi)、受體類(lèi)、轉運體類(lèi)3種不同類(lèi)別。

（1）酶類(lèi)報告基因。HSV1-tk報告基因是目前研究較為深入、應用較為廣泛的一種酶類(lèi)PET報告基因。其沒(méi)有嚴格的底物特異性，可以與核素標記的核苷類(lèi)似物（底物探針）相結合并催化其磷酸化，從而將其捕獲至細胞內，通過(guò)PET顯像實(shí)現免疫細胞的在體可視化報告基因成像。為了進(jìn)一步提高HSV1-tk報告基因顯像的靈敏度和特異性，Likar等構建了HSV1-tk報告基因的突變衍生物HSV-sr39tk（39位絲氨酸突變?yōu)榫彼幔?。與此同時(shí)，與野生型和突變型HSV1-tk特異性結合的報告基因探針也得到了充分研究和發(fā)展，如4-[18F]氟-3-[羥甲基]丁基鳥(niǎo)嘌呤{4-18F-fluoro-3-[hydroxymethyl]butyl guanine，18F-FHBG}、2′-脫氧-2′ - [18F]氟-5-乙基-1-beta-D-阿拉伯呋喃糖尿嘧啶{2′-deoxy-2′-[18F]fluoro-5-ethyl-1-beta-D-arabinofuranosyluracil，18F-FEAU}和2′-氟-2′-脫氧-5′-[124I]碘1-D-阿拉伯呋喃糖尿嘧啶{2′-fluoro-2′-deoxy-5′-[124I]iodo-1-D-arabinofuranosyluracil，124I-FIAU}等。通過(guò)體內和體外實(shí)驗，Miyagawa等對多種HSV1-tk報告基因探針的PET顯像有效性進(jìn)行了比較。

總體而言，124I-FIAU和18F-FEAU探針在PET顯像的靈敏度和信噪比方面優(yōu)于18F-FHBG，但是在探針合成方面，18F比124I更易獲得。Dotti等在2只靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物體內進(jìn)行的顯像研究顯示，18F-FEAU PET/CT能夠在多個(gè)淋巴器官及感染部位觀(guān)察并監測到過(guò)繼回輸于機體內的、表達HSV-sr39tk報告基因的獼猴自身多克隆T淋巴細胞。18F-FHBG及其PET顯像已經(jīng)FDA批準可以用于臨床。在1篇腦膠質(zhì)瘤患者的個(gè)案報道中，同時(shí)表達HSV1-tk報告基因以及腫瘤靶向受體治療基因的CD8＋細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）在靜脈回輸于患者體內后，不但能特異性靶向腫瘤組織局部，還可通過(guò)PET顯像實(shí)現細胞在腫瘤組織局部的可視化監測。過(guò)繼回輸免疫細胞的活化狀態(tài)及功能的發(fā)揮對于腫瘤細胞免疫治療的成功與否至關(guān)重要，而HSV1-tk報告基因及124I-FIAU報告探針系統能夠有效監測T細胞活化狀態(tài)。除了作為報告基因用于報告基因分子顯像外，HSV1-tk還是一種很重要的自殺基因，在腫瘤基因治療中發(fā)揮重要作用。表達HSV1-tk的腫瘤細胞，能夠將無(wú)毒性的藥物前體（如阿昔洛韋、更昔洛韋等）進(jìn)行磷酸化，使其成為有毒性的三磷酸核苷類(lèi)似物，該類(lèi)似物可以取代正常DNA合成過(guò)程中的三磷酸核苷酸，抑制細胞DNA聚合酶，使DNA鏈的延長(cháng)終止，從而抑制蛋白質(zhì)的合成，導致腫瘤細胞死亡。

非人源化的酶類(lèi)報告基因中，除了HSV1-tk外，還有水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶（varicella-zoster virus thymidine kinase，VZV-tk）和β-半乳糖苷酶（LacZ）。與報告基因VZV-tk相對應的報告探針——雙環(huán)核苷類(lèi)似物（bicyclic nucleoside analogues，BCNA）能通過(guò)血-腦屏障，有可能應用于中樞神經(jīng)系統腫瘤的PET報告基因顯像，從而在一定程度上解決了HSV1-tk報告基因及相應探針系統不能突破血-腦屏障方面的問(wèn)題；而報告基因LacZ及其探針系統多應用于MRI。

（2）受體類(lèi)報告基因。SSTR屬于7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體家族，共有5種受體亞型，在小鼠和人類(lèi)中，該受體高度保守，并且在絕大多數組織器官中表達量均較低。但是，由于在多個(gè)人類(lèi)腫瘤類(lèi)型中均檢測到人源SSTR2（human SSTR2, hSSTR2）的高水平表達，以hSSTR2為靶點(diǎn)的腫瘤治療和PET報告基因顯像監測得以迅速發(fā)展。在以多種核素標記的生長(cháng)激素抑制素衍生物作為報告探針的hSSTR2 PET報告基因顯像研究中，因能在hSSTR2表達陽(yáng)性的細胞中迅速內化富集，而且脫靶探針能夠迅速通過(guò)泌尿系統代謝清除，68Ga-DOTA-TOC在眾多的hSSTR2特異性報告探針中尤其受人關(guān)注。小動(dòng)物68Ga-DOTA-TOC PET顯像研究結果表明，藥物注射后2 h，就能在穩定表達hSSTR2報告基因蛋白的腫瘤部位檢測到68Ga-DOTA-TOC的特異性濃聚，其攝取值是肌肉的500倍，是普通荷瘤部位的64倍。68Ga-DOTA-TOC的hSSTR2 PET報告基因顯像有望成為腫瘤基因治療和細胞治療過(guò)程中重要的在體無(wú)創(chuàng )分子影像監測手段。

相對于酶類(lèi)報告基因而言，受體類(lèi)報告基因目前在腫瘤細胞免疫治療PET報告基因顯像研究中的應用較少。但是，因hSSTR2等受體類(lèi)報告基因蛋白多屬于人源蛋白，可以避免在人體研究應用過(guò)程中的免疫原性問(wèn)題，因而其發(fā)展前景較為樂(lè )觀(guān)。除hSSTR2外，多巴胺2型受體（dopamine 2 receptor, D2R）及其突變體（D2R80A）作為報告基因相關(guān)蛋白用于分子影像研究也較為多見(jiàn)，包括PET報告基因顯像及MRI報告基因顯像。

（3）轉運體類(lèi)報告基因。人源NIS（human NIS, hNIS）是一種人體固有的跨膜糖蛋白，可作為一種報告基因相關(guān)蛋白用于過(guò)繼免疫細胞的在體PET動(dòng)態(tài)監測。巨噬細胞作為一種重要的免疫細胞，在慢性炎性病變、惡性腫瘤等的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著(zhù)重要作用，實(shí)現巨噬細胞的在體無(wú)創(chuàng )動(dòng)態(tài)可視化監測，對于疾病的診斷、治療和預后判斷意義重大。Seo等的研究顯示，穩定表達hNIS蛋白的巨噬細胞株（RAW264.7/hNIS）與未經(jīng)改造的巨噬細胞系（RAW264.7）相比，其在細胞增殖能力、細胞因子分泌活性和吞噬活性等方面，并沒(méi)有發(fā)生顯著(zhù)改變，但其體外125I攝取值卻升高了約65倍；進(jìn)一步的小動(dòng)物PET顯像結果表明，皮下注射了RAW264.7/hNIS細胞的炎性病變模型裸鼠，其炎性病變局部的124I攝取值是注射RAW264.7細胞的炎性病變模型裸鼠的2.12倍，說(shuō)明hNIS報告基因PET顯像能夠有效監測巨噬細胞遷移至炎性病變局部這一動(dòng)態(tài)過(guò)程。樹(shù)突狀細胞（dendritic cell, DC）是機體功能最強的專(zhuān)職抗原提呈細胞，在機體免疫反應、腫瘤疫苗治療和腫瘤細胞免疫治療中均發(fā)揮重要作用，所以實(shí)現DC的在體動(dòng)態(tài)監測能夠有效指導腫瘤的免疫治療。Lee等的研究顯示，在C57BL/6小鼠的左右足跖處分別注射原始的DC和穩定表達hNIS的DC，注射1 d后的124I小動(dòng)物PET/CT顯像結果表明，后者引流淋巴結區域的124I攝取量顯著(zhù)高于前者，且這種顯著(zhù)攝取可以持續增高并維持到注射第4天。由此可見(jiàn)，將hNIS作為PET顯像報告基因，能夠有效監測DC的在體遷移情況，有助于優(yōu)化基于DC的腫瘤細胞免疫治療策略。

人源的去甲腎上腺素轉運體（human norepinephrine transporter, hNET）也是一種細胞跨膜蛋白，也可作為一種報告基因相關(guān)蛋白用于PET顯像。與hNET相對應的報告探針，如123I-MIBG或124I-MIBG已廣泛應用于臨床。但是其顯像時(shí)間點(diǎn)在注射后24 h，如果能夠合成適合18F標記的MIBG類(lèi)似物[如間位氟代芐胍（meta-fluorobenzylguanidine, MFBG）和對位氟代芐胍（para-fluorobenzylguanidine, PFBG）]，基于hNET報告基因顯像時(shí)間點(diǎn)將能夠提前至注射后8 h內。研究表明，通過(guò)構建穩定表達hNET蛋白的大鼠膠質(zhì)瘤C6細胞株（C6/hNET）和荷C6/hNET小鼠模型，18F-MFBG探針能夠于藥物注射后1～4 h對小鼠異體移植瘤進(jìn)行PET顯像；此外，18F-MFBG還具有標記合成條件溫和、機體清除快、非靶組織攝取少等優(yōu)點(diǎn)，是一種優(yōu)越的hNET特異的PET報告基因探針。

2.人源化的PET報告基因研究

限制腫瘤細胞免疫治療的PET報告基因顯像研究發(fā)展的一個(gè)重要因素就是外源性報告基因相關(guān)蛋白的免疫原性問(wèn)題。細菌或病毒來(lái)源的報告基因相關(guān)蛋白作為一種外源蛋白，會(huì )引發(fā)免疫活性個(gè)體的抗報告基因相關(guān)蛋白的免疫反應。在HIV感染的患者體內，的確也檢測到了針對報告基因蛋白相關(guān)胸苷激酶（thymidine kinase, TK）的HIV特異性CTL細胞的免疫排斥反應，而人源化的報告基因蛋白能夠有效解決這一問(wèn)題。利用人源性的線(xiàn)粒體2型TK蛋白（human mitochondrial thymidine kinase 2, hmTK2）作為報告基因相關(guān)蛋白標記免疫細胞，通過(guò)以124I-FIAU和18F-FEAU作為報告探針的PET顯像，可以實(shí)現免疫細胞在體的長(cháng)期動(dòng)態(tài)可視化監測。盡管hmTK2在哺乳動(dòng)物細胞的線(xiàn)粒體中廣泛表達，但其并不能有效接觸到作為其底物的尿嘧啶核苷類(lèi)似物報告探針。通過(guò)構建hmTK2的截短體，讓其在細胞胞質(zhì)中表達，便能有效識別尿嘧啶核苷類(lèi)似物報告探針，從而實(shí)現PET報告基因顯像。在1項多種人源PET報告基因的對比研究中，研究者通過(guò)構建hNET、hNIS、HSV1-tk、人源脫氧胞苷雙突變體（human deoxycytidine kinase double mutant, hdCKDM）等報告基因相關(guān)蛋白穩定表達的T細胞，并將其分別注入小鼠皮下，再通過(guò)在體T細胞的報告基因PET顯像，探討并研究不同人源報告基因類(lèi)型對T細胞在體PET顯像的靈敏度，結果表明，相比于18F-FEAU/hdCKDM、124I/hNIS和18F-FEAU/HSV1-tk系統，18F-MFBG/hNET PET系統的靈敏度最高，在體T細胞監測量可低至3.5×104 ～4.0×104級別。

人源化報告基因的PET顯像目前是一個(gè)研究熱點(diǎn)，但其中仍存在2個(gè)潛在問(wèn)題：（1）當人源化報告基因在機體某些組織細胞中有內源性表達時(shí)，如何實(shí)現過(guò)繼免疫細胞特異性的PET報告基因顯像；（2）免疫細胞中該人源化報告基因相關(guān)蛋白是否會(huì )發(fā)揮類(lèi)似于內源性蛋白的功能，從而影響免疫細胞自身的功能。這些都有待在日后人源化報告基因研究過(guò)程中逐步加以解決。

3.腫瘤細胞免疫治療的報告基因多模態(tài)顯像

任何一種報告基因和分子影像手段都存在一定的局限性。對于受體或轉運體類(lèi)報告基因而言，因涉及到蛋白折疊、胞內運輸和在細胞膜表面的整合定位等多個(gè)步驟，可能會(huì )對報告基因PET顯像產(chǎn)生影響；而對于酶類(lèi)報告基因而言，雖然存在酶類(lèi)催化反應的放大效應，但是報告探針需要穿透細胞膜進(jìn)入細胞內，在被酶類(lèi)報告基因相關(guān)蛋白催化后，才能得以顯像，這在一定程度上也會(huì )影響到報告基因顯像的效能?；诙喾N報告基因類(lèi)型和多種分子影像手段的多模態(tài)顯像也因此成為目前報告基因分子顯像領(lǐng)域的另一研究熱點(diǎn)。表達光學(xué)報告基因相關(guān)蛋白（如GFP和熒光素酶等）和PET報告基因相關(guān)蛋白（HSV1-tk）融合蛋白的造血干/祖細胞和間充質(zhì)干細胞，再次回輸到機體內后，可通過(guò)光學(xué)和PET顯像對其進(jìn)行在體的長(cháng)期動(dòng)態(tài)監測。Mayer-Kuckuk等將表達了HSV1-tk、GFP和螢火蟲(chóng)熒光素酶等多種報告基因融合蛋白的骨髓細胞注入小鼠體內，通過(guò)PET和光學(xué)顯像，觀(guān)察并長(cháng)期動(dòng)態(tài)監測了移植骨髓細胞在體的生物學(xué)分布及數量和功能變化。與此同時(shí)，PET/MR和光學(xué)PET（opti-PET）等分子影像設備的研發(fā)和應用也正在日益興起。

綜上，PET報告基因顯像作為一種先進(jìn)的在體無(wú)創(chuàng )分子影像手段，在腫瘤細胞免疫治療的臨床研究中應用越來(lái)越廣泛，能夠實(shí)現對免疫細胞在體運輸、生物學(xué)分布、存活擴增、活化狀態(tài)和免疫功能發(fā)揮等的長(cháng)時(shí)間連續動(dòng)態(tài)監測。HSV1-tk及其突變衍生物是目前研究較為深入、應用也較為廣泛的一種酶類(lèi)報告基因相關(guān)蛋白，但其免疫原性可在人體內引發(fā)嚴重的免疫排斥反應，從而限制了其進(jìn)一步的臨床研究應用。人源化的報告基因/探針系統能夠在一定程度上解決上述問(wèn)題，同時(shí)通過(guò)報告基因的多模態(tài)顯像，能夠整合多種分子影像手段的優(yōu)勢，彌補單一影像學(xué)方法的不足。

盡管腫瘤細胞免疫治療的PET報告基因顯像具有眾多優(yōu)勢，但其前提是免疫細胞均需事先通過(guò)體外基因改造來(lái)誘導表達報告基因相關(guān)蛋白，這一過(guò)程可能會(huì )影響到免疫細胞的活性和功能。由于活化的免疫細胞是一種處于高代謝狀態(tài)的細胞，其中眾多生化信號通路均會(huì )發(fā)生改變，若能通過(guò)靶向這些通路中的內源性蛋白分子，就不但能夠實(shí)現免疫細胞的在體直接核素標記及PET顯像，還不會(huì )影響細胞原有的活性和功能。在自身免疫性腦炎實(shí)驗小鼠模型中，利用炎性病變浸潤活化淋巴細胞的18F-FDG PET顯像，實(shí)現了脊髓炎性病灶的可視化監測。除了糖代謝之外，核苷酸的補救合成途徑也是活化免疫細胞的一個(gè)重要代謝特點(diǎn)。18F-氟阿拉伯呋喃糖胞嘧啶（18F-fluoroarabinofuranosyl cytosine，18F-FAC）作為一種新的核苷酸類(lèi)PET探針，相比于18F-FLT和18F-FDG，在小鼠抗腫瘤免疫模型中，能夠更加特異性地聚集于腫瘤組織局部的引流淋巴結，直接優(yōu)先標記其中浸潤的活化免疫細胞，從而實(shí)現免疫細胞功能活化的在體無(wú)創(chuàng )可視化監測。以上這些均為目前腫瘤細胞免疫治療PET報告基因顯像的研究熱點(diǎn)，實(shí)現廣泛的臨床轉化應用是其最終目標。

來(lái)源：中華核醫學(xué)與分子影像雜志