目的:利用嗎啉代寡核苷酸技術(shù)建立下調斑馬魚(yú)lmna基因的技術(shù)方法。
方法:在斑馬魚(yú)lmna基因序列中選擇靶點(diǎn),設計針對斑馬魚(yú)lmna基因的嗎啉代寡核苷酸序列(lmna-MO),構建能特異指示lmna基因表達的lmna-EGFP-pCS2+重組質(zhì)粒,并通過(guò)顯微注射方式將二者共注射入斑馬魚(yú)胚胎中,通過(guò)觀(guān)察胚胎中綠色熒光表達量反應lmna基因表達量,并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測胚胎中lamin蛋白表達量。
結果:蛋白質(zhì)印跡法檢測斑馬魚(yú)體內lamin蛋白的表達,分別有大小為69 KD和62 KD兩種蛋白表達。設計并構建了lmna-MO和重組質(zhì)粒lmna-EGFP-pCS2+,單獨注射lmna-EGFP-pCS2+質(zhì)粒后觀(guān)察到從6 hpf到96 hpf胚胎均有綠色熒光蛋白表達;二者共注射后觀(guān)察到,與對照組相比,實(shí)驗組從6 hpf至30 hpf胚胎中綠色熒光蛋白表達量均不同程度下降或消失;蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗結果顯示實(shí)驗組胚胎內lamin蛋白表達量明顯下降。表明已成功下調了斑馬魚(yú)胚胎lmna基因表達。
結論:可通過(guò)lmna-MO和重組質(zhì)粒lmna-EGFP-pCS2+共注射方法下調斑馬魚(yú)lmna基因表達,并通過(guò)綠色熒光蛋白表達量反映下調效果。該方法可為深入研究人核纖層病提供良好的動(dòng)物模型。