1.雪貂血清學(xué)篩選  雪貂在感染前進(jìn)行流感的血清學(xué)篩選，至少目的流感病毒血清學(xué)檢測結果為陰性的動(dòng)物方可入組。

　　2.材料與方法

　　(1)實(shí)驗用病毒：為SPF雞胚傳代所收獲的尿囊液。測定病毒液TCID50為10的8次方/ml。

　　(2)動(dòng)物及感染方法：4～10月齡雪貂，體重500～1000g，感染前進(jìn)行血清抗體檢測，檢查H5N1病毒抗體及當即流行的流感的抗體為陰性的雪貂為合格，可入選實(shí)驗。雪貂經(jīng)鼻腔接種100TCID50(500μl體積)。所有動(dòng)物實(shí)驗均在A(yíng)BSL-3實(shí)驗室中進(jìn)行。感染的第5天安樂(lè )處死雪貂取材。

　　(3)臨床觀(guān)察：雪貂實(shí)驗前皮下植入芯片，每天通過(guò)芯片讀取體溫一次，每天稱(chēng)量體重一次，觀(guān)察有無(wú)咳嗽、流涕、嘔吐、腹瀉、氣促、呼吸困難、明顯食欲缺乏等臨床表現，詳細記錄備案。

　　(4)病毒分離：在病毒接種1d后，每天收鼻甲骨活檢物標本，放入1ml DMEM培養液中備用。標本接種MDCK細胞，吸附1小時(shí)，進(jìn)行病毒分離。感染后第5天感染雪貂安樂(lè )處死，尸檢時(shí)取肺、氣管、肝、脾、腦、腸、心和腎組織，研磨處理后，接種MDCK細胞。每天觀(guān)察細胞病變，持續觀(guān)察3d，用火雞紅細胞測定HA確認。HA方法具體為：將接種標本的MDCK細胞上清液取出50μl，加入等體積火雞紅細胞，室溫反應30min，出現凝集反應，結果為陽(yáng)性。

　　(5)H5N1病毒RNA的檢測：在H5N1病毒接種動(dòng)物1d后，每天收集鼻甲骨活檢物，在A(yíng)BSL-3實(shí)驗室內提取病毒RNA，操作步驟：將100μl鼻甲骨活檢物標本移入裂解液(Qiagen)中，放入buffer RLT(已加入1％巰基乙醇)350μl，4℃13000rpm離心3min，將上清轉移至新1.5ml微量離心管中，提取鼻甲骨活檢物樣品病毒核酸。將RNA逆轉成cDNA，通過(guò)熒光定量PCR儀直接測定病毒載量。

　　(6)H5N1病毒抗體檢測：動(dòng)物在處死后采血分離血清，－80℃下保存備用。血清H5N1病毒性抗體檢測(H1方法)具體操作步驟為：每孔加入1：10～1：1280稀釋的待檢血清，加入8HA的病毒，室溫孵育30min。此后檢測凝集結果，血清凝集的效價(jià)為該血清可中和的抗體的效價(jià)。

　　(7)病理學(xué)研究：大體觀(guān)察，處死動(dòng)物后，詳細觀(guān)察肺、心、脾、腎、肝、腦、腸以及淋巴結等組織的形態(tài)變化；病理切片制備，取處死動(dòng)物的肺等組織，10％甲醛固定，石蠟包埋，常規病理組織切片處理后，HE或免疫組織化學(xué)染色后，鏡檢觀(guān)察。

　　3.雪貂感染H5N1模型指標和結果  雪貂在實(shí)驗前1周測正常體溫和體重，確定正常值，雪貂在H5N1病毒接種的第2天時(shí)體溫升高，體溫升高0.5～2℃，體溫升高持續3d左右，臨床有死亡現象。雪貂感染后出現流涕，打噴嚏，有呼吸困難，攝食減少，精神萎靡，活動(dòng)度下降，對外界刺激無(wú)反應等臨床表現。病毒感染雪貂后第1天到第5天，用RT-PCR方法可從鼻甲骨活檢物中檢測到病毒載量。從雪貂的鼻甲骨標本、肺組織標本中，經(jīng)MD- CK細胞培養，接種細胞產(chǎn)生典型細胞病變(CPE)，提示病毒感染了雪貂并有病毒的復制和排毒，鼻甲骨標本分離陽(yáng)性的高峰期在2～6d?？稍谀X、心、肝、脾、腸、腎、淋巴結組織中分離到活病毒，此結果證明H5N1病毒可以在呼吸道以外的組織器官中復制、繁殖。用HA方法可證實(shí)MDCK細胞有H5N1抗原存在。在H5N1病毒接種前和接種后第5天安樂(lè )時(shí)，經(jīng)靜脈采血1ml分離血清，檢測血清中H5N1病毒特異性抗體。感染雪貂在5天安樂(lè )死時(shí)，均為陰性。解剖大體觀(guān)察可發(fā)現肺組織表面局部有輕度實(shí)變現象，鏡檢可見(jiàn)肺泡腔內的明顯炎性滲出物，伴有淋巴細胞、吞噬細胞浸潤。肺間隔廣泛增寬伴大量單核細胞為主的炎細胞浸潤，肺泡受壓變形變小，并有局限性肺泡間隔增寬后相互融合，部分區域有大片狀肺泡間隔增寬后相互融合。肺泡間隔內有淋巴細胞、漿細胞、吞噬細胞，病變范圍廣泛，呈中重度間質(zhì)性肺炎。