1.雪貂血清學(xué)篩選  雪貂在感染前進(jìn)行流感的血清學(xué)篩選，至少目的流感病毒血清學(xué)檢測結果為陰性的動(dòng)物方可入組。

　　2.材料和方法

　　(1)實(shí)驗用病毒：為SPF雞胚傳代所收獲的尿囊液。測定病毒液TCID50為10的7次方/ml。

　　(2)動(dòng)物及感染方法：4～10月齡雪貂，體重500～1000g，感染前進(jìn)行血清抗體檢測，檢查A(H1N1)病毒抗體及當即流行的流感的抗體為陰性的雪貂為合格，可入選實(shí)驗。雪貂經(jīng)鼻腔接種10的6次方TCID50(500μl體積)。所有動(dòng)物實(shí)驗均在A(yíng)BSL-3實(shí)驗室中進(jìn)行。感染的第5天安樂(lè )處死雪貂取材。

　　(3)臨床觀(guān)察：雪貂實(shí)驗前皮下植入芯片，每天通過(guò)芯片讀取體溫一次，每天稱(chēng)量體重一次，觀(guān)察有無(wú)咳嗽、流涕、嘔吐、腹瀉、氣促、呼吸困難、明顯食欲缺乏等臨床表現，詳細記錄備案。

　　(4)病毒分離：在病毒接種1d后，每天收鼻甲骨活檢物，放入1ml DMEM培養液中備用。標本接種MDCK細胞，吸附1h，進(jìn)行病毒分離。感染后第5天感染雪貂安樂(lè )處死，尸檢時(shí)取肺、氣管、肝、脾、腦、腸、心和腎組織，研磨處理后接種MDCK細胞。每天觀(guān)察細胞病變，持續觀(guān)察3天，用火雞血細胞測定HA確認。HA方法具體為：將接種標本的 MDCK細胞上清液取出50μl，加入等體積火雞血細胞，室溫反應30min，出現凝集反應，結果為陽(yáng)性。

　　(5)H1N1病毒RNA的檢測：在H1N1病毒接種動(dòng)物1d后，每天收集鼻甲骨活檢物，在A(yíng)BSL-3實(shí)驗室內提取病毒RNA，操作步驟：將100μl鼻甲骨活標本移入裂解液(Qia- gen)中，放入buffer RLT(已加入1％巰基乙醇)350μl，4℃13000次/分離心3min，將上清轉移至新1.5ml微量離心管中，提取鼻甲骨活檢物樣品病毒核酸。將RNA逆轉成cDNA，通過(guò)熒光定量PCR儀直接測定病毒載量。

　　(6)H1N1病毒抗體檢測：動(dòng)物在處死后采血分離血清，－80℃下保存備用。血清 H5N1病毒性抗體檢測(H1方法)具體操作步驟為：每孔加入1：10～1：1280稀釋的待檢血清，加入8HA的病毒，室溫孵育30min。此后檢測凝集結果，血清凝集的效價(jià)為該血清可中和的抗體的效價(jià)。

　　(7)病理學(xué)研究：大體觀(guān)察，處死動(dòng)物后，詳細觀(guān)察肺、心、脾、腎、肝、腦、腸以及淋巴結等組織的形態(tài)變化；病理切片制備，取處死動(dòng)物的肺等組織，10％甲醛固定，石蠟包埋，常規病理組織切片處理后，HE或免疫組織化學(xué)染色后，鏡檢觀(guān)察。

　　3.雪貂感染A(H1N1)模型指標和結果  雪貂在實(shí)驗前1周測正常體溫和體重，確定正常值，雪貂在H1N1病毒接種的第2天時(shí)體溫升高，體溫升高0.5～1℃，體溫升高持續1～2d左右，臨床沒(méi)有死亡現象。雪貂感染后出現流涕，打噴嚏，有呼吸困難，攝食減少，精神萎靡，活動(dòng)度下降等臨床表現。病毒感染雪貂后第1～5天，用RT-PCR方法可從鼻甲骨活檢物中檢測到病毒載量，病毒載量呈現下降趨勢。雪貂的鼻甲骨標本經(jīng)MDCK細胞培養，結果顯示感染后第1～2天的鼻甲骨標本可分離出病毒，此后結果為陰性。

　　肺組織和腸組織可分離到活病毒，未在其他組織分離到病毒。大體觀(guān)察可見(jiàn)肺組織局灶性充血改變，呈暗紅色。鏡檢可見(jiàn)肺組織呈局灶性中-重度肺炎改變，部分肺組織病變較輕，呈局灶性間質(zhì)性肺炎改變，表現為肺泡間隔增寬，肺泡壁毛細血管充血、炎細胞浸潤。部分肺組織病變較重，表現為肺靜脈及肺泡壁毛細血管明顯擴張充血，部分肺靜脈壁及周?chē)M織明顯水腫，局部支氣管及肺泡上皮細胞壞死、脫落，肺泡腔內可見(jiàn)大量滲出和漏出的紅細胞、水腫液、炎細胞及壞死脫落的上皮細胞碎屑，有時(shí)可見(jiàn)病灶廣泛融合，累及大部分甚至整個(gè)肺葉。