CRISPR-Cas9系統在活細胞中的工作機制取得重大突破
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發(fā)布時(shí)間：2016-09-05
在一項新的研究中，來(lái)自美國馬薩諸塞大學(xué)醫學(xué)院的研究人員揭示出CRISPR-Cas9系統在活細胞中的內部工作機制的重要新細節。這一發(fā)現可能對人們利用這種強大的基因編輯工具開(kāi)發(fā)治療方法產(chǎn)生影響。相關(guān)研究結果發(fā)表在2016年8月29日那期Journal of Cell Biology期刊上，論文標題為“CRISPR-Cas9 nuclear dynamics and target recognition in living cells”。
論文通信作者、馬薩諸塞大學(xué)醫學(xué)院細胞生物學(xué)教授和生物化學(xué)與分子藥理學(xué)教授Thoru Pederson博士說(shuō)，“我們對CRISPR-Cas9復合物如何在活細胞的基因組中到處移動(dòng)和發(fā)現靶位點(diǎn)的細節了解得并不多。在這項研究中，我們了解到這種復合物的工作機制對尋求為實(shí)驗室研究和潛在的診所應用開(kāi)發(fā)工具的基因編輯人員而言是比較重要的和有用的?！?/span>
作為抵抗病毒入侵的細菌免疫系統中的一種組分，CRISPR-Cas9復合物是一種強大的基因編輯系統。這種CRISPR-Cas9復合物比之前的基因編輯技術(shù)更加高效和更加準確，因而科學(xué)家們在實(shí)驗室中發(fā)現對它進(jìn)行改造和快速地運送它的方法，從而選擇性地對特異性的基因序列進(jìn)行編輯。為了切割雙鏈DNA片段，CRISPR-Cas9利用由大約20個(gè)核苷酸組成的向導RNA（gRNA）靶向結合基因組中的特異性序列，在那里，Cas9隨后進(jìn)行切割。這允許科學(xué)家們移除特定的基因序列或將它們插入到宿主細胞基因組中。
鑒于CRISPR-Cas9系統在活細胞內的工作機制的內在動(dòng)力學(xué)性質(zhì)并未得到很好地理解，一些運送系統和技術(shù)相比而言更容易取得成功。為了觀(guān)察CRISPR-Cas9系統在活細胞中的作用機制，Pederson博士和同事們開(kāi)發(fā)出一種利用不同的熒光分子對gRNA和Cas9進(jìn)行標記的技術(shù)，因此能夠同時(shí)追蹤它們。
研究人員發(fā)現當未結合到Cas9上時(shí)，gRNA是非常短命的。當Cas9與gRNA組裝在一起時(shí)，這種復合物更加穩定：大約一半的復合物在細胞核中的壽命大約為15分鐘，而剩下的復合物具有更高的穩定性。
論文共同第一作者、Pederson實(shí)驗室研究員Hanhui Ma博士說(shuō)，“Cas9讓gRNA穩定化。如果你將gRNA和Cas9各自地運送到靶細胞中，然后進(jìn)行組裝，那么它將是沒(méi)有工作效率的，這是因為一些gRNA將會(huì )發(fā)生降解。如果你將它們---已經(jīng)組裝在一起---同時(shí)運送到靶細胞中，那么你將觀(guān)察到更多的活性?！?/span>
研究人員還觀(guān)察到Cas9-gRNA復合物在靶位點(diǎn)上的停留時(shí)間決定著(zhù)DNA是否將被切割。當gRNA序列與靶DNA序列完美匹配時(shí)，Cas9-gRNA復合物在離開(kāi)之前，結合到這種靶DNA序列上長(cháng)達兩個(gè)小時(shí)，在這期間，靶DNA序列切割也完成了。當gRNA序列與靶DNA序列存在錯配時(shí)，Cas9-gRNA復合物在靶DNA序列上的停留時(shí)間僅僅為幾分鐘的時(shí)間，因而這種切割被破壞了。
Ma說(shuō)，了解到這一點(diǎn)后，科學(xué)家們能夠潛在地在數學(xué)上基于CRISPR-Cas9復合物在基因組位點(diǎn)上的停留時(shí)間長(cháng)短，預測脫靶切割可能在何處發(fā)生。
Ma說(shuō)，“我們仍然不知道CRISPR的規則。每個(gè)人都想知道當它被運送到活細胞中時(shí)將會(huì )發(fā)生什么。這項研究揭示了它的工作機制的一部分?！?span style="font-size:14px;">（轉載于生物谷）
