Northern Blot
繼分析DNA的Southern雜交方法出現后，1977年Alwine等人提出一種與此相類(lèi)似的、用于分析細胞總RNA或含poly A尾的RNA樣品中特定mRNA分子大小和豐度的分子雜交技術(shù)，這就是與Southern相對應而定名的Northern雜交技術(shù)。這一技術(shù)自出現以來(lái)，已得到廣泛應用，成為分析mRNA最為常用的經(jīng)典方法。
與Southern雜交相似，Northern雜交也采用瓊脂糖凝膠電泳，將分子量大小不同的RNA分離開(kāi)來(lái)，隨后將其原位轉移至固相支持物（如尼龍膜、硝酸纖維膜等）上，再用放射性（或非放射性）標記的DNA或RNA探針，依據其同源性進(jìn)行雜交，最后進(jìn)行放射自顯影（或化學(xué)顯影），以目標RNA所在位置表示其分子量的大小，而其顯影強度則可提示目標RNA在所測樣品中的相對含量（即目標RNA的豐度）。但與Soughern雜交不同的是，總RNA不需要進(jìn)行酶切，即是以各個(gè)RNA分子的形式存在，可直接應用于電泳；此外，由于堿性溶液可使RNA水解，因此不進(jìn)行堿變性，而是采用甲醛等進(jìn)行變性電泳。雖然Northern也可檢測目標mRNA分子的大小，但更多的是用于檢測目的基因在組織細胞中有無(wú)表達及表達的水平如何。
一、 試劑準備
1. 0.5M EDTA: EDTA 16.61g加ddH2O至80ml, 調pH至8.0, 定容至100ml。
2． 50mM NaAc: NaAc 3.4g 加ddH2O至500ml, 加DEPC 0.5ml, 振蕩, 37℃過(guò)夜，高壓滅菌。
3． 5×甲醛凝膠電泳緩沖液: MOPS [3-(N-瑪琳代)丙磺酸] 10.3g加50mM NaAc 400ml, 用2N NaOH調pH至7.0, 再加入0.5M EDTA 10ml, 加DEPC H2O至500ml。無(wú)菌抽濾，室溫避光保存。
4． 20×SSC: NaCl 175.3g、檸檬酸三鈉88.2g，加ddH2O至800ml，用2N NaOH調pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml。DEPC處理、高壓滅菌。
5. 6×SSC: 20×SSC 300ml加ddH2O至1000ml。DEPC處理,高壓滅菌。
6．50×Denhardt : 聚蔗糖0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g、牛血清白蛋白(BSA)0.5g加dd H2O至50ml,無(wú)菌抽濾、分裝。
7．1M Na2HPO4: Na2HPO4·12H2O 35.81g, 加dd H2O至100ml。
8. 1M NaH2PO4: NaH2PO4·2H2O 15.6g, 加dd H2O至100ml。
9. 0.1M 磷酸鈉緩沖液(pH 6.6): Na2HPO4 35.2ml加NaH2PO4 64.8ml 。
10.STE緩沖液: 1M Tris-HCl(pH 8.0) 2.5ml,0.5M EDTA, 0.5ml,5M NaCl 5ml，加dd H2O至250ml。
11.預雜交液: 20×SSC 5ml,甲酰胺10ml,50×Denhardt 4ml,1M磷酸鈉緩沖液0.2ml（pH6.6）,10%SDS 1ml, 總體積 20ml。臨用前加入變性鮭魚(yú)精DNA（10mg/ml）,使終濃度為4μl/ml。
12. DEPC H2O: 1000mldd H2O中加入DEPC 1ml，充分振蕩，37℃過(guò)夜，高壓滅菌。
二、操作步驟
1. 總RNA提?。阂?jiàn)相關(guān)內容。
2. 變性膠的制備：取瓊脂糖0.2g，加入DEPC H2O 12.4ml，加熱熔化，于保溫狀態(tài)下加入5×甲醛凝膠電泳緩沖液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混勻、制膠。待膠凝固后，置1×甲醛凝膠電泳緩沖液中預電泳5min。
3. 樣品制備：取總RNA4.5μl(約20-30μg) ，加入5×甲醛凝膠電泳緩沖液 4.0μl、37%甲醛3.6μl、甲酰胺10μl，65℃溫育15min、冰浴5min。加入EB（1μg/μl）1μl、上樣緩沖液2μl。
4. 電泳：上樣，50V電泳（電泳時(shí)間約2hr左右）。電泳結束后將膠塊置紫外燈下，觀(guān)察RNA的完整性，記錄18S、28S條帶的位置（離加樣孔的距離）。
5. 將RNA從變性膠轉移到硝酸纖維素膜或尼龍膜：
(1) 按膠塊大小剪取膜一張，用DEPC水中浸濕后，置于20×SSC中浸泡1hr。剪去膜一角。
(2)將膠塊切去一角，并在20×SSC浸泡15min×2次。
(3)用長(cháng)和寬均大于凝膠的一塊有機玻璃板作為平臺，將其放入大的干烤皿上，上面放一張Whatman 3MM濾紙，倒入20×SSC使液面略低于平臺表面，當平臺上方的3MM濾紙濕透后，用玻棒趕出所有氣泡。
(4)將凝膠翻轉后置于平臺上濕潤的3MM濾紙中央，3MM濾紙和凝膠之間不能滯留氣泡。
(5)用Parafilm膜圍繞凝膠四周，以此作為屏障，阻止液體自液池直接流至膠上方的紙巾。
(6) 在凝膠上方放置預先已浸濕的尼龍膜，排除膜與凝膠之間的氣泡。
(7) 將二張已濕潤的、與凝膠大小相同的3MM濾紙置于膜的上方，排除濾紙與濾膜之間的氣泡。
(8) 將一疊（5-8cm厚）略小于3MM濾紙的紙巾置于3MM濾紙的上方，并在紙巾上方放一塊玻璃，然后用一個(gè)重約500克的重物壓在玻璃板上。其目的是建立液體自液池經(jīng)凝膠向膜上行流路，以洗脫凝膠中的RNA并使其聚集在膜上。
6.使上述RNA轉移持續進(jìn)行15hr左右。在轉膜過(guò)程中，當紙巾浸濕后，應更換新的紙巾。
7.轉移結束后，揭去凝膠上方的紙巾和3MM濾紙。將膜在6×SSC中浸泡5 min，以去除膜上殘留的凝膠。
8.將凝膠置紫外燈下，觀(guān)察膠塊上有無(wú)殘留的RNA。
9.膜置80℃，真空干烤1-2hr?？靖珊蟮哪び盟芰洗芊?，4℃保存備用。
10. 探針標記(Prime-a-Gene Labeling System, Promega公司)：
（1） 取模板DNA 25ng于0.5ml離心管中，95-100℃變性5min，冰浴5min。
（2） dNTPmix的制備: 取dGTP 1μl、dATP 1μl、dTTP 1μl混勻。
（3）將下列反應成份混合，加入上述微量離心管中：
dNTPmix 2.0μl
BSA(10mg/ml ) 2.0μl
5×buffer 10.0μl
Klenow 酶(5u/μl) 1.0μl
α-32P-dCTP 5.0μl
加入適量dd H2O使反應總體積達50μl，輕輕混勻。室溫下反應1hr。
11.預雜交：將膜的反面緊貼雜交瓶，加入預雜交液5ml，42℃預雜交3hr。
12.雜交：將變性的探針（95-100℃變性5min，冰浴5min）加入到預雜交液中，42℃雜交16hr。
13.洗膜：
(1)傾去雜交液。
(2)2×SSC/0.1%SDS室溫洗15min。
(3)0.2×SSC/0.1%SDS，55℃洗15min×2次。
14.壓片：將膜用dd H2O漂洗片刻，用濾紙吸去膜上水份。用薄型塑料紙將膜包好，置于暗盒中，在暗室中壓上X光片。暗盒置-70℃放射自顯影3～7天左右。
三、注意事項
1．操作時(shí)必須仔細、小心，嚴格按同位素操作規程進(jìn)行，以防止同位素污染。
2．必要時(shí)，可采用Sephades G-50柱層析法純化標記的探針（見(jiàn)本節附錄），以去除標記反應中未結合的（游離的）核苷酸。
3．膜的重復使用：結合了待測RNA的膜與探針雜交后，可經(jīng)堿或熱變性方法將探針洗脫，膜可反復使用與其它探針雜交。方法如下：雜交的膜（注意：雜交過(guò)的膜在保存過(guò)程中不能干燥，否則探針將會(huì )與膜形成不可逆的結合）置 100℃ 0.5% SDS中煮沸3min，自然冷卻至室溫后，將膜放入雙蒸水中漂洗2-3遍。取出膜，用濾紙吸去膜表面的水份。將膜直接進(jìn)行另一種探針的雜交或用保鮮膜包好，室溫下真空保存。
（本文轉載丁香園）
