亚洲国产一级毛片视频-无码人妻久久一区二区三区-国产一级黄色毛片视频-精品中文字幕久久久久久-亚洲精品影院综合在线观看

新浪微博
微信互動(dòng)
首 頁(yè)

siRNA的制備

發(fā)布人：admin 瀏覽次數：1165 發(fā)布時(shí)間：2017-10-12


       目前為止較為常用的方法有通過(guò)化學(xué)合成，體外轉錄，長(cháng)片斷dsRNAs經(jīng)RNase III 類(lèi)降解 (e.g. Dicer,E. coli, RNase III)體外制備siRNA，以及通過(guò)siRNA表達載體或者病毒載體，PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達產(chǎn)生siRNA。

體外制備
1.化學(xué)合成
       許多國外公司都可以根據用戶(hù)要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA。主要的缺點(diǎn)包括價(jià)格高，定制周期長(cháng)，特別是有特殊需求的。由于價(jià)格比其他方法高，為一個(gè)基因合成3—4對siRNAs的成本就更高了，比較常見(jiàn)的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進(jìn)行化學(xué)合成。
       最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進(jìn)行研究
       不適用于：篩選siRNA等長(cháng)時(shí)間的研究，主要原因是價(jià)格因素


2.體外轉錄

       以DNA Oligo為模版，通過(guò)體外轉錄合成siRNAs，成本相對化學(xué)合成法而言比較低，而且能夠比化學(xué)合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實(shí)驗的規模受到限制，雖然一次體外轉錄合成能提供足夠做數百次轉染的siRNAs，但是反應規模和量始終有一定的限制。而且和化學(xué)合成相比，還是需要占用研究人員相當的時(shí)間。值得一提的是體外轉錄得到的siRNAs毒性小，穩定性好，效率高，只需要化學(xué)合成的siRNA量的1/10就可以達到化學(xué)合成siRNA所能達到的效果，從而使轉染效率更高。
       最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學(xué)合成的價(jià)格成為障礙時(shí)。
       不適用于：實(shí)驗需要大量的，一個(gè)特定的siRNA。長(cháng)期研究。


3.用RNase III 消化長(cháng)片斷雙鏈RNA制備siRNA

       其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設計和檢驗多個(gè)siRNA序列以便找到一個(gè)有效的siRNA。而用這種方法——制備一份混合有各種siRNAs“混合雞尾酒” 就可以避免這個(gè)缺陷。選擇通常是200—1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉錄的方法制備長(cháng)片斷雙鏈dsRNA
，然后用RNase III (or Dicer)
       在體外消化，得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒(méi)有被消化的dsRNA后，這個(gè)siRNA混合物就可以直接轉染細胞，方法和單一的siRNA轉染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。
       dsRNA消化法的主要優(yōu)點(diǎn)在于可以跳過(guò)檢測和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節省時(shí)間和金錢(qián)（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不過(guò)這種方法的缺點(diǎn)也很明顯，就是有可能引發(fā)非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關(guān)的基因?，F在多數的研究顯示這種情況通常不會(huì )造成影響。
       最適用于：快速而經(jīng)濟地研究某個(gè)基因功能缺失的表型
       不適用于：長(cháng)時(shí)間的研究項目，或者是需要一個(gè)特定的siRNA進(jìn)行研究，特別是基因治療


體內表達

       前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs，并且需要專(zhuān)門(mén)的RNA轉染試劑將siRNAs轉到細胞內。而采用siRNA表達載體和基于PCR的表達框架則屬于：從轉染到細胞的DNA模版中在體內轉錄得到siRNAs。這兩種方法的優(yōu)點(diǎn)在于不需要直接操作RNA。


4. siRNA表達載體

       多數的siRNA表達載體依賴(lài)三種RNA聚合酶III 啟動(dòng)子(pol III)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)在哺乳動(dòng)物細胞中的表達。這三類(lèi)啟動(dòng)子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動(dòng)子和人H1啟動(dòng)子。之所以采用RNA pol III啟動(dòng)子是由于它可以在哺乳動(dòng)物細胞中表達更多的小分子RNA，而且它是通過(guò)添加一串（3到6個(gè)）U來(lái)終止轉錄的。要使用這類(lèi)載體，需要訂購2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應載體的pol III 啟動(dòng)子下游。由于涉及到克隆，這個(gè)過(guò)程需要幾周甚至數月的時(shí)間，同時(shí)也需要經(jīng)過(guò)測序以保證克隆的序列是正確的。
       siRNA表達載體的優(yōu)點(diǎn)在于可以進(jìn)行較長(cháng)期研究——帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續抑制靶基因的表達，持續數星期甚至更久。
病毒載體也可用于siRNA表達，其優(yōu)勢在于可以直接高效率感染細胞進(jìn)行基因沉默的研究，避免由于質(zhì)粒轉染效率低而帶來(lái)的種種不便,而且轉染效果更加穩定。
       最適用于：已知一個(gè)有效的siRNA序列，需要維持較長(cháng)時(shí)間的基因沉默。
       不適用于：篩選siRNA序列（其實(shí)主要是指需要多個(gè)克隆和測序等較為費時(shí)、繁瑣的工作）。


5. siRNA表達框架

       siRNA表達框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達模版，包括一個(gè)RNA pol III啟動(dòng)子，一段發(fā)夾結構siRNA，一個(gè)RNA pol III終止位點(diǎn)，能夠直接導入細胞進(jìn)行表達而無(wú)需事前克隆到載體中。和siRNA表達載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測序等頗為費時(shí)的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時(shí)間。因此，SECs成為篩選siRNA的最有效工具，甚至可以用來(lái)篩選在特定的研究體系中啟動(dòng)子和siRNA的最適搭配。如果在PCR兩端添加酶切位點(diǎn)，那么通過(guò)SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構建siRNA表達載體。構建好的載體可以用于穩定表達siRNA和長(cháng)效抑制的研究。
       這個(gè)方法的主要缺點(diǎn)是①PCR產(chǎn)物很難轉染到細胞中   ②不能進(jìn)行序列測定，PCR和DNA合成時(shí)可能差生的誤讀不能被發(fā)現導致結果不理想。
       最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動(dòng)子

       不適用于：長(cháng)期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了）


       （本文轉載丁香通）

上一篇：小分子RNA－－microRNA
下一篇：RNAi實(shí)驗介紹
分享到：