1. RNAi 介紹

       RNA 干擾（RNAi:RNA interference）是由諾貝爾生理學(xué)/醫學(xué)獎得主 Andrew Z. Fire 和 Craig C. Mello（1）在線(xiàn)蟲(chóng)實(shí)驗中發(fā)現的，2001 年 Elbashir 等人發(fā)現哺乳類(lèi)的 siRNA 可以進(jìn)行 RNAi 誘導。這個(gè)方法與常規方法相比更加簡(jiǎn)便，現在已經(jīng)成為一種常用的抑制基因功能的方法，也屬于研究工具之一。

       RNAi 是 21~23bp 的短鏈雙鏈 RNA（siRNA:small interfering RNA）或者是長(cháng)鏈雙鏈 RNA（dsRNA:double-strand RNA），與目的基因表達的 mRNA 同源區進(jìn)行特異性結合，使 mRNA 降解，達到抑制基因表達的作用。

       RNAi 活性與轉位子的移動(dòng)、基因表達抑制和細胞命運決定有關(guān)。并且是防止病毒感染的重要因子之一。RNAi 的發(fā)現對核酸醫藥研究和基因治療的應用有很大幫助。

       （1）Fire, A.at al .,Nature 391: 806-811

       （2）Elbashir SM, at al :Nature 411:494-498

2. RNAi 實(shí)驗用品

       RNAi 實(shí)驗用品大致可以分為「將 siRNA 導入細胞誘導 RNAi」和「檢測 RNAi 效果」的試劑、設備等機器。必須的機器、試劑如下所示：

       細胞培養設備——CO2 培養箱和超凈臺

       siRNA 樣品——合成 siRNA、sh/siRNA 載體

       導入 siRNA 的試劑、儀器——轉染試劑、電穿孔、病毒載體 n 檢測 RNAi 效果的試劑、儀器——RT-PCR、報告基因載體、分光光度計、熒光顯微鏡、熒光分光光度計、Northern Blotting 裝置和定量系統

3. siRNA 干擾效果

3.1 siRNA 的形式?jīng)Q定 RNAi 干擾效果

       我們需要根據研究對象的細胞和基因的特征，去選擇合成 sh/siRNA 形式的表達載體。如果實(shí)驗對象是哺乳動(dòng)物細胞，使用培養細胞時(shí)需要確定以下兩點(diǎn)：

       使用的 siRNA 是否能有 RNAi 干擾效果/目標的序列是否有效序列 n 目的基因是否容易敲除

3.1.1 合成的 siRNA

       直接用合成的 siRNA, 屬于瞬時(shí)轉染。

       可直接購買(mǎi)市售商品或定制合成的 siRNA。

       對照 siRNA:Cosmo 對照 siRNA、Wako 對照 siRNA

3.1.2 質(zhì)粒載體或者病毒載體

       基本都是瞬時(shí)轉染，但是可以建立穩定細胞株（穩定轉染）。使用病毒粒子時(shí)會(huì )被基因組整合，可以構建穩定細胞株。

       構建質(zhì)?；蛘卟《据d體，要從以下三點(diǎn)開(kāi)始考慮：

       A. 啟動(dòng)子：聚合酶 II 或聚合酶 III 系統

       B. 載體：質(zhì)粒載體或者病毒載體

       C. RNA 表達方法：siRNA 表達系統或者 shRNA 表達系統當使用原代培養細胞或者非分裂細胞等難以轉染的細胞時(shí)，除了慢病毒載體外，也可以使用比病毒更安全的 GenomONETM -Neo EX HVJ-E 仙臺病毒包膜轉染試劑，無(wú)需包裝病毒，直接將 siRNA 與病毒包膜溶液混合，按照常規流程轉染，即可達到病毒轉染的效果?？s短實(shí)驗周期，根據結果，靈活更換 siRNA 序列。

3.2 siRNA  序列設計

       了解了 RNAi 的干擾機制后，需要設計既能避免脫靶又可以高效敲除的 siRNA 序列?？梢允褂妹赓M使用的設計工具，也可以直接購買(mǎi)已經(jīng)設計好的產(chǎn)品。

3.2.1 使用合成 siRNA

       請根據商品說(shuō)明書(shū)使用。

3.2.2 構建 si/shRNA 表達載體

       即使設計好了 siRNA 序列，也不一定能夠適用于載體表達。這是因為在細胞內從載體表達到 siRNA 產(chǎn)生的過(guò)程與很多因素有關(guān)。如果需要用到載體，則實(shí)驗計劃就必須考慮這一點(diǎn)，最好設計一個(gè)載體也適用的序列。

       進(jìn)行 shRNA 序列設計的同時(shí)合成對應的 siRNA, 能夠有效的進(jìn)行預備試驗，在體外驗證 siRNA 的功能。

3.3 合成 siRNA 的方法

       siRNA 是在 3『末端的突出端含有兩個(gè)堿基的 21~23 個(gè)堿基的雙鏈 RNA, 通常經(jīng)過(guò)退火處理后即可使用。

3.3.1 購買(mǎi)退火處理的雙鏈 siRNA

       siRNA 序列指定：一般指定目標基因序列

       堿基數指定：基本 21~27 堿基

       懸突體指定：寡 RNA 或者嵌合寡 RNA-DNA

       有義鏈和反義鏈之間不對稱(chēng)的地方會(huì )列出

       通常含有退火緩沖液，沒(méi)有的話(huà)會(huì )列出

       *有兩堿基的懸突體通常會(huì )用于胸腺嘧啶和尿嘧啶。當然使用其他懸突體對 RNAi 的效果也沒(méi)有太大的影響。但是為了使 siRNA 末端平滑，通常會(huì )使 5 末端懸突，如果改變懸突體的長(cháng)度有時(shí)候會(huì )影響 RNAi 的效果 Elbashir et al., EMBO J,20:6877-6888

例：siRNA 指定序列

       目的基因序列：5’ - CGGAAGATGAAGAGGAAGA - 3’

       有義序列 5’- CGGAAGUGAAGAGGAAAGATT - 3’
       反義序列 5’- UCUUCCUCUUCAUCUUCCGTT - 3

3.3.2 購買(mǎi)單鏈 RNA

       購買(mǎi)單鏈 RNA 后也可以親自進(jìn)行退火操作

       可以選擇使用寡 RNA 或者嵌合寡 RND-DNA

       通常 RNA 的糖鏈中 2′會(huì )有保護基，需要先進(jìn)行脫保護*2001 年曾經(jīng)有報告指出從目的基因的 AA 開(kāi)始 19 堿基的配合序列比 RNAi 的效果更好。所以大多數研究人員開(kāi)始使用以 AA 開(kāi)始的 19 堿基作為 siRNA 的目的序列，文獻上會(huì )寫(xiě)成 AA+19. 根據這些文獻的資料 [AA+19+2 延伸的懸突體（合計 23 堿基），合成雙聯(lián) siRNA 時(shí)，合成出的序列會(huì )和文獻上記載的不同。

       （1）Nature , 411, 494-498, 2001

       （2）EMBO J., 20, 6877-6888, 2001

       （3）Genes Dev., 15, 188-200, 2001

3.4 si/shRNA 表達載體的構建

       決定了使用的 si/shRNA 序列和表達載體后，然后就要決定進(jìn)行亞克隆位點(diǎn)。一般情況，啟動(dòng)子從 polIII 開(kāi)始作為轉錄起始位點(diǎn)。

       需要注意，它與堿基序列（嘌呤堿基）相關(guān)。

3.4.1 插入設計的序列

       如下圖所示，通常從限制酶末端插入序列

3.4.2 獲得 oligoDNA

       如下所示獲得兩條 oligoDNA

       退火后，啟動(dòng)子連接到載體，亞克隆通過(guò)測序檢測。

3.5 陽(yáng)性對照和陰性對照的選擇

       繼續 RNAi 實(shí)驗時(shí)，需要同時(shí)進(jìn)行陽(yáng)性對照 siRNA 和陰性對照 siRNA 實(shí)驗。陰性對照實(shí)驗進(jìn)行時(shí)需要使用與所有基因序列不同的序列（就是說(shuō)沒(méi)有 RNAi 效果的序列），陽(yáng)性對照實(shí)驗需要使用高效的 RNAi 序列。需要提前確認進(jìn)行 RNAi 細胞 RNAi 的干擾效果（RNAi 效果的持續性和表達抑制效率）和再次進(jìn)行獨立實(shí)驗確定重復性。但是 DNA 質(zhì)粒和合成 siRNA 的轉染的最適條件不一樣，必須要使用最適合合成 siRNA 的條件。

       *可以使用以下三種中其中一種：

       市售的對照 siRNA（基因組上不存在的序列）

       能夠進(jìn)行 RNAi 干擾，但不存在于生物基因組的基因作為目的 siRNA
       例：使用哺乳類(lèi)細胞時(shí)，用熒光素酶基因或者 GFP 基因作為目的 siRNAn

       根據目的基因特異性 siRNA 序列，不改變 G、A、U、C 各種核苷酸的比例只隨機改變序列，做出在基因組上序列不同序列的 siRNA

3.6  siRNA 轉染細胞后 siRNA 的純化

       當進(jìn)行 siRNA 藥理研究時(shí)，RNAi 后需要純化 siRNA，來(lái)研究 RNAi 效果、siRNA 代謝過(guò)程、體內 siRNA 的穩定性、毒性/副作用、非特異性 mRNAs 的脫靶效應。

       可用小 RNA 純化試劑盒，或者 Ago1~Ago4 抗體，得到純化的 siRNA.

4. 細胞轉染

4.1 決定轉染方法

       使用合成 siRNA 或者 si/shRNA 表達載體進(jìn)行 RNAi 干擾實(shí)驗時(shí)，須導入到細胞中。如果有培養細胞的設備，只需要確定轉染的方法就可以了。

       目前市面上有各種類(lèi)型轉染試劑，脂質(zhì)體轉染試劑、病毒型轉染試劑、多聚物轉染試劑、體內轉染試劑等，可以根據試驗需求選擇合適的轉染方法。

4.1.1 使用合成 siRNA 和質(zhì)粒載體

       由于是瞬時(shí)轉染，所以要盡可能提高轉染效率。需要根據使用細胞的轉染效率和細胞毒性等性質(zhì)來(lái)決定轉染試劑的種類(lèi)和是否使用電穿孔法。

4.2 研究轉染條件

       使用轉染試劑（以下只是舉例，詳細請參考轉染試劑的說(shuō)明書(shū)）

       1）在 6 孔板中培養細胞，24 小時(shí)后達到 50~70% 融合。

       2）在 MEM（無(wú)血清）中加入陽(yáng)性對照 siRNA（1μL 100μM 的樣品）。如有 GFP 等報告載體存在時(shí)，可以進(jìn)行共轉染。

       3）調整各種轉染試劑的濃度

       A: 在培養基（無(wú)血清）中添加 1μL 轉染試劑最終變成 100μL.

       B: 在培養基（無(wú)血清）中添加 2μL 轉染試劑最終變成 100μL……等。

       4）將第 2 步的 siRNA 溶液分別添加到第三部調整好的轉染試劑中，充分混合，在室溫 15℃ 下靜置。

       5）用培養基清洗細胞后，添加 0.8 mL 培養基（無(wú)血清）。

       6）將第 4 步中調整好的 siRNA 轉染試劑復合物，分別滴到培養板中 

       7）培養數小時(shí)

       8）添加 1 mL 含有正常劑量的血清和抗生素的 MEM, 培養 24~48 小時(shí)。實(shí)際上這是為了確認轉染試劑和導入 siRNA 后是否發(fā)生其他問(wèn)題，必須要從在 siRNA 存在和不存在，這兩方面確認。需要選擇細胞毒性低敲除效果好的條件。

5. RNAi 實(shí)驗中要注意的地方

5.1 目的基因的選擇

5.1.1 確定目的基因的表達量

5.1.2 盡可能獲得 mRNA 和蛋白質(zhì)的轉錄信息

       如果目的基因無(wú)法表達，RNAi 誘導實(shí)驗則不能進(jìn)行。細胞或者基因自身的周期等因素對 mRNA 表達造成的影響也很重要。同時(shí)需要根據 mRNA 的壽命和代謝時(shí)間優(yōu)化實(shí)驗條件。

5.2 決定使用的細胞系

       根據研究目的選擇使用的細胞系，但是細胞系不同，有可能難以導入 siRNA 或者細胞內 RNAi 干擾核心的 DICER 和 RISC 水平不同，產(chǎn)生干擾素反應活化等。另外，特別是進(jìn)行瞬時(shí)轉染時(shí)，要達到 siRNA 高效轉染，首先應該使用容易轉染的細胞去確認 siRNA 的敲除效果。

5.3 嘗試多種 siRNA

       如果 1 種 siRNA 無(wú)法得到期待的效果，可以對一種目的基因使用多種 siRNA 進(jìn)行敲除實(shí)驗。另外，也需要確定使用不同有敲除效果的 siRNA 會(huì )不會(huì )得到同種表現型。這是因為多數 siRNA 引起的脫靶反應幾乎不會(huì )一樣。

5.4 siRNA 的保存方法

5.4.1 要小心酶引起的降解和機械分解

       1）保存在 RNase-free 的環(huán)境中。

       2）使用的試管、水或者緩沖液都要是 RNase-free.

       3）分裝保存，避免反復凍融。

5.4.2 溶解方法

       按照說(shuō)明溶解合成的 siRNA, 然后調整調整儲存母液濃度。合成濃度應該在 200μm 以下，一般是 50~100μM.

5.4.3 保存方法

       1）干燥狀態(tài)

       在-20℃ 下可以保存一年。

       2）溶解保存

       反復凍結然后溶解會(huì )導致 siRNA 分解，所以需要根據實(shí)驗劑量考慮是將 siRNA 溶液分裝還是冷凍保存，-20℃ 以下可以穩定保存半年。

       要注意冷凍箱內的溫度上升導致凍結溶解。

5.4.4 實(shí)驗注意事項

       一旦溶解后將 siRNA 保存在 4℃ 時(shí)，一星期內可以用于實(shí)驗，這僅限于在 RNase-free 的狀態(tài)。

       保存時(shí)要十分小心，一旦 siRNA 活性降低，將它冷凍保存并使用儲存的母液 .

5.5 RESCUE 實(shí)驗

       將有 siRNA 不能識別的核酸序列的目的基因導入就能夠將表現型重置，所以有幾種可以作為 RNAi 的 RESCUE 實(shí)驗 n 導入目的基因的變異核酸序列

       對應目的基因的 cDNA 克隆，不改變野生蛋白質(zhì)序列直接導入變異核酸序列，就能夠確定 siRNA 效果是否 rescuen 使用標記 3′UTR 的 siRNA 和 ORF 克隆


       使用標記了 3′UTR 的目的基因 siRNA 進(jìn)行敲除實(shí)驗就能確定表現型。然后使用在 CDS 域的 ORF 克隆編碼（open reading frame clone）進(jìn)行 RESCUE 實(shí)驗。

       *難以調節目的蛋白質(zhì)的表達量，而且如果過(guò)剩表達可能會(huì )產(chǎn)生危害，所以 RESCUE 實(shí)驗是一種難以使用的方法。

6. 使用 RNAi 技術(shù)的體內實(shí)驗和體外實(shí)驗對應 siRNA

6.1 合成 siRNA

6.1.1 沒(méi)有末端修飾

       可以沒(méi)有末端修飾的 siRNA（nakid-siRNA）的方法和 2′-OME,2′-F 等有末端改性基的 siRNA 的方法。

6.1.2 合成 siRNA 的純度

       In vivo 實(shí)驗中使用的 siRNA 純度要盡可能高，產(chǎn)品最好是不含內毒素并且是在 GMP 準許制作設施中制造。

6.2 siRNA 表達載體

       有雙鏈 siRNA 表達系統、擁有發(fā)夾結構的 shRNA 表達系統等，涉及 siRNA 表達方式、驅動(dòng) siRNA 的啟動(dòng)子種類(lèi)等。

6.3 慢病毒系統

       慢病毒系統可以通過(guò)核膜，不受細胞分裂期影響，能夠將片段整合到宿主基因組中。已有報道可以導入到腦或者神經(jīng)細胞中。

       如果您擔心病毒的安全性問(wèn)題，可以用 GenomONETM 替代病毒轉染。

       （文章轉載丁香通）