慢病毒包裝簡(jiǎn)要步驟及注意事項
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發(fā)布時(shí)間：2016-09-03
慢病毒包裝簡(jiǎn)要步驟
以六孔板中的1孔為例，每個(gè)樣品需要1×106個(gè)293T細胞。
1. 取1.5 ml滅菌EP管，加入1.5 μg包裝混合質(zhì)粒和0.5 μg表達質(zhì)粒以及250 μl的無(wú)血清培養基。輕柔混勻，室溫孵育5 min。
2. 取1.5 ml滅菌EP管，取9 μl 脂質(zhì)體2000 l溶于250 μl無(wú)血清培養基中。輕柔混勻，室溫孵育5 min。
3. 將DNA溶液和脂質(zhì)體溶液輕柔混勻。室溫孵育20 min
4. 用胰酶消化并記數293T細胞。用含血清的培養基重懸細胞。
5. 在六孔板中每孔，加入1 ml含血清的生長(cháng)培養基，再加入DNA-脂質(zhì)體復合物。
6. 將1 ml重懸的293T細胞(1×106個(gè)細胞/ml)加入到平板中。37 ℃ CO2孵箱中孵育過(guò)夜。
7. 移除含有DNA-脂質(zhì)體復合物的培養基移除，代之以DMEM(含丙酮酸鈉和非必須氨基酸)。
7. 轉染后48-72 h收獲含病毒的上清。3000 rpm 離心20 min，去除沉淀。
8. 病毒上清-80 ℃貯存。
包裝出來(lái)的慢病毒對NIH/3T3細胞達90%以上感染效率。
注意事項
1. 在慢病毒感染細胞前，為檢測病毒上清培養液內病毒的活性，并確定病毒與轉染細胞之間的比率，需要確定病毒的滴度。病毒的滴度可以通過(guò)轉染Hela細胞，然后使用抗體篩選穩定的細胞轉染株，進(jìn)行計數和數值統計。
2. 在慢病毒轉染細胞的過(guò)程中最重要的一步是融合，只有一些較小的慢病毒載體才能轉導進(jìn)細胞，因此，病毒顆粒的吸附是慢病毒轉染的限速步驟。.
