RNA凝膠電泳試驗
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發(fā)布時(shí)間：2016-09-20
實(shí)驗基本原理
RNA可以使用非變性或變性凝膠電泳進(jìn)行檢測。在非變性電泳中，可以分離混合物中不同分子量的RNA分子，凡是無(wú)法確定分子量。只有在變性情況下，RNA分子完全伸展，其泳動(dòng)率才與分子量成正比。
判斷RNA提取物的完整性是進(jìn)行電泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的電泳圖譜應可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三條帶，且28s rRNA的亮度應為18s rRNA的兩倍。
實(shí)驗試劑
1、0.1%DEPC水：200ml雙蒸去離子水加0.2mlDEPC焦炭酸、二乙酯混勻，室溫放置過(guò)夜，高壓滅菌。
2、10x電泳緩沖液：?jiǎn)徇榛撬幔∕OPS）0.4mol/L（pH 7.0）；NaAc 0.1mol/L；乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L；
3、50mL變性瓊脂糖凝膠（1%）：10x電泳緩沖液5 mL；瓊脂糖0.5 g；0.1%DEPC水36.5 mL；加熱溶解，稍冷卻，加入8.5 ml 37%甲醛。
4、上樣緩沖液：50%甘油，1mmol/LEDTA，0.4% 溴酚蘭，0.4%二甲苯藍。
5、甲酰胺（去離子）。
操作步驟
1、將制膠用具用70%乙醇沖洗一遍，晾干備用。
2、制膠：稱(chēng)取0.5g瓊脂糖粉末，加入放有36.5mL的DEPC水的錐形瓶中，加熱使瓊脂糖完全溶解。稍冷卻后加入5ml的10x電泳緩沖液、8.5ml的甲醛。然后在膠槽中灌制凝膠，插好梳子，水平放置待凝固后使用。
3、加樣：在一個(gè)潔凈的小離心管中混合以下試劑：電泳緩沖液（10x）2μl、甲醛3.5ml、甲酰胺10ml、RNA樣品3.5μl?；靹?，置60℃保溫10min，冰上速冷。加入3μl的上樣緩沖液混勻，取適量加樣于凝膠點(diǎn)樣孔內。同時(shí)點(diǎn)RNA標準樣品。
4、電泳：打開(kāi)電泳儀，穩壓7.5V/cm電泳。
5、電泳結束后通過(guò)紫外透視儀觀(guān)察。
注意事項
本實(shí)驗中必須保持RNase污染以免RNA降解。所有試劑用DEPC水配制，用具也用DEPC水沖洗，并滅菌。
