RNA的變性瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗原理、材料和操作步驟
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發(fā)布時(shí)間：2016-09-22
一、實(shí)驗目的
學(xué)習RNA瓊脂糖凝膠電泳的使用技術(shù)。
二、實(shí)驗原理
RNA可以使用非變性或變性凝膠電泳進(jìn)行檢測。在非變性電泳中，可以分離混合物中不同分子量的RNA分子，凡是無(wú)法確定分子量。只有在變性情況下，RNA分子完全伸展，其泳動(dòng)率才與分子量成正比。
判斷RNA提取物的完整性是進(jìn)行電泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的電泳圖譜應可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三條帶，且28s rRNA的亮度應為18s rRNA的兩倍。
三、材料、試劑及器具
1、 材料
總RNA提取物。
2、 試劑
（1）0.1%DEPC水：200ml雙蒸去離子水加0.2mlDEPC焦炭酸、二乙酯混勻，室溫放置過(guò)夜，高壓滅菌。
（2）10x電泳緩沖液。
嗎啉代丙烷磺酸（MOPS） 0.4mol/L（pH 7.0）
NaAc 0.1mol/L
乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L
（3）50mL變性瓊脂糖凝膠（1%）
（4）10x電泳緩沖液 5 mL
瓊脂糖 0.5 g
0.1%DEPC水 36.5 mL
加熱溶解，稍冷卻，加入8.5 mL 37%甲醛。
（5）上樣緩沖液：50%甘油，1mmmol/LEDTA，0.4% 溴酚蘭，0.4%二甲苯藍。
（6）甲酰胺（去離子）。
3、器具
（1）電泳系統
（2）紫外透視儀
四、操作步驟
1、 將制膠用具用70%乙醇沖洗一遍，晾干備用。
2、 制膠：
稱(chēng)取0.5g瓊脂糖粉末，加入放有36.5mL的DEPC水的錐形瓶中，加熱使瓊脂糖完全溶解。稍冷卻后加入5mL的10x電泳緩沖液、8.5mL的甲醛。然后在膠槽中灌制凝膠，插好梳子，水平放置待凝固后使用。
3、 加樣：
在一個(gè)潔凈的小離心管中混合以下試劑：電泳緩沖液（10x）2μl、甲醛3.5mL、甲酰胺10mL、RNA樣品3.5μl?；靹?，置60℃保溫10min，冰上速冷。加入3μl的上樣緩沖液混勻，取適量加樣于凝膠點(diǎn)樣孔內。同時(shí)點(diǎn)RNA標準樣品。
4、 電泳：
打開(kāi)電泳儀，穩壓7.5V/cm電泳。
5、 電泳結束后通過(guò)紫外透視儀觀(guān)察。
五、注意事項
本實(shí)驗中必須保持RNase污染以免RNA降解。所有試劑用DEPC水配制，用具也用DEPC水沖洗，并滅菌。
