RNA結合蛋白免疫沉淀（RIP）技術(shù)(二)
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發(fā)布時(shí)間：2016-09-28
一、RIP技術(shù)簡(jiǎn)介
由于miRNA被發(fā)現在癌癥機理中起重要的作用，尤其是與腫瘤轉移相關(guān)聯(lián)，因此對于miRNA的研究來(lái)說(shuō)，最讓人興奮的是有希望應有于癌癥治療中的RNA 抑制療法或模擬miRNA表達療法，尤其是對于出現腫瘤轉移的癌癥病人的治療。
但是miRNA具有成百上千個(gè)靶標，所以要完全理解一個(gè)miRNA和靶標的特異性反應與腫瘤發(fā)生之間的聯(lián)系，是一項非常具有挑戰性的工作，尤其是在癌癥研究中鑒別出miRNA的準確靶點(diǎn)仍然是一大難題?，F已知道miRNA的調節功能是通過(guò)結合不同的蛋白質(zhì)或RNA來(lái)實(shí)現的，因此研究miRNA與蛋白的結合情況對于揭示miRNA的功能及指導RNA療法的研發(fā)具有重要意義。Robert Nakamura博士是Advanced Genetic Systems公司的首席執行官，作為驗證RNA-蛋白復合物作為治療靶點(diǎn)有效性的專(zhuān)家，他認為“我們知道RNA結合蛋白在不同的生理狀態(tài)下會(huì )結合不同的RNA。通過(guò)從細胞中分離完整的RNA-蛋白復合物，我們可以確認分子間的特異性相互作用，從而有希望為治療疾病找到破壞這些相互作用的方法?！?/span>
RIP技術(shù)（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA結合蛋白免疫沉淀），是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術(shù)，是了解轉錄后調控網(wǎng)絡(luò )動(dòng)態(tài)過(guò)程的有力工具，能幫助我們發(fā)現miRNA的調節靶點(diǎn)。RIP這種新興的技術(shù)運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來(lái)，然后經(jīng)過(guò)分離純化就可以對結合在復合物上的RNA進(jìn)行分析。RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類(lèi)似應用，但由于研究對象是RNA-蛋白復合物而不是DNA-蛋白復合物，RIP實(shí)驗的優(yōu)化條件與ChIP實(shí)驗不太相同（如復合物不需要固定，RIP反應體系中的試劑和抗體絕對不能含有RNA酶，抗體需經(jīng)RIP實(shí)驗驗證等等）。RIP技術(shù)下游結合microarray技術(shù)被稱(chēng)為RIP-Chip，幫助我們更高通量地了解癌癥以及其它疾病整體水平的RNA變化。
基于磁珠的RIP實(shí)驗流程
RIP 實(shí)驗基本原理：
? 用抗體或表位標記物捕獲細胞核內或細胞質(zhì)中內源性的RNA結合蛋白。
? 防止非特異性的RNA的結合。
? 免疫沉淀把RNA結合蛋白及其結合的RNA一起分離出來(lái)。
? 結合的RNA序列通過(guò)microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或 高通量測序（RIP-Seq）方法來(lái)鑒定。
延伸閱讀： 95%的人類(lèi)基因組并不編碼基因，而是產(chǎn)生大量的非編碼RNA，真正編碼蛋白質(zhì)的基因只占人類(lèi)總基因組的約2%。這些非編碼RNA在生命的生長(cháng)發(fā)育的各個(gè)階段都發(fā)揮著(zhù)重要的調節作用，與艾滋病、白血病、糖尿病、畸形等多種病變密切相關(guān)，并且參與著(zhù)干細胞和表觀(guān)遺傳學(xué)調控。而RNA-蛋白復合物驅動(dòng)了幾乎所有細胞過(guò)程的基因表達的轉錄后調控，包括剪接（splicing）、出核轉運（nuclear export）、mRNA 穩定性以及蛋白轉譯過(guò)程，因此，對基因調控的了解就有賴(lài)于確定這些過(guò)程中RNA的結合的變化。因此，RNA研究也被越來(lái)越多的科學(xué)家重視起來(lái)，目前已經(jīng)成為生命科學(xué)研究中一個(gè)炙手可熱的領(lǐng)域，而RIP技術(shù)也逐漸成為RNA研究領(lǐng)域的一項常規方法，幫助我們了解越來(lái)越受關(guān)注的轉錄后調控網(wǎng)絡(luò )。
