RNA免疫沉淀常見(jiàn)問(wèn)題解答
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發(fā)布時(shí)間：2016-09-23
1. miRNA是什么？具有什么作用？
答：microRNAs（miRNA）是一種內源性非編碼小分子RNA，一般具有18到25個(gè)核苷酸，其序列在進(jìn)化上高度保守，通過(guò)靶向特定mRNA來(lái)調節基因的表達。
miRNA是越來(lái)越受關(guān)注的轉錄后調控網(wǎng)絡(luò )（post-transcriptional control）中重要的調控因子。首先，miRNA結合到核糖核蛋白（Ribonucleoprotein，RNP）復合物中，形成RNA誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex, RISC），然后通過(guò)不完全的堿基互補靶向到目標mRNA的3’UTR區，再通過(guò)引導酶切影響了mRNA的穩定性，或直接阻礙翻譯過(guò)程，從而介導特異mRNA靶標的轉錄后基因沉默。
2. RIP技術(shù)是什么？
答：RIP技術(shù)（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA結合蛋白免疫沉淀），是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術(shù)，是了解轉錄后調控網(wǎng)絡(luò )動(dòng)態(tài)過(guò)程的有力工具，能幫助我們發(fā)現miRNA的調節靶點(diǎn)。RIP這種新興的技術(shù)運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來(lái)，然后經(jīng)過(guò)分離純化就可以對結合在復合物上的RNA進(jìn)行分析。
3. RIP技術(shù)與ChIP技術(shù)有什么區別？
答：RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類(lèi)似應用，但由于研究對象是RNA-蛋白復合物而不是DNA-蛋白復合物，RIP實(shí)驗的優(yōu)化條件與ChIP實(shí)驗不太相同（如復合物不需要固定，RIP反應體系中的試劑和抗體絕對不能含有RNA酶，抗體需經(jīng)RIP實(shí)驗驗證等等）。
4. RIP試驗基本原理
答：
（1）用抗體或表位標記物捕獲細胞核內或細胞質(zhì)中內源性的RNA結合蛋白。
（2）防止非特異性的RNA的結合。
（3）免疫沉淀把RNA結合蛋白及其結合的RNA一起分離出來(lái)。
（4）結合的RNA序列通過(guò)microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或 高通量測序（RIP-Seq）方法來(lái)鑒定。
5. RIP試驗需要注意什么？
答：
（1）防止RNA與蛋白非特異性結合。
（2）避免RNA蛋白質(zhì)結合被破壞。
（3）避免外源RNase污染。
（4）抑制內源RNase的活性。
（5）選擇適合做RIP的抗體。
（6）避免RNA結合蛋白的降解。
6. 為什么抗體無(wú)法沉淀RIP裂解液中的目標蛋白？
答：
（1）先進(jìn)行IP或者WB，測試抗體可以與目標RBP結合。
（2）另選一個(gè)能與抗原其他表位結合的抗體。
（3）盡可能選用密理博RIPAb+抗體。
（4）稀釋抗體成濃度梯度，進(jìn)行IP測試。
（5）4℃過(guò)夜孵育抗體與RIP裂解液。
（6）確定抗體類(lèi)型與Protein A/Protein G匹配。
7. 提取RNA時(shí)，蛋白酶K消化不完全是什么原因？
答：當進(jìn)行蛋白酶K消化時(shí)，確保水浴溫度應設置在55℃左右，長(cháng)期在65℃以上孵育會(huì )導致蛋白酶K失活。
8. 提取RNA后，A260/A280比值偏離1.8~2.2區域是什么原因？
答：
（1）需要縮短酚氯仿提取RNA的時(shí)間間隔。
（2）測試提純后RNA中是否存在RNA酶，可能RNA發(fā)生了降解。
9. 做RIP的時(shí)候和beads孵育的lysate的濃度如何確定？有些動(dòng)物的文獻提到用細胞板數細胞個(gè)數，想知道如果用蛋白濃度的話(huà)，大概在什么數量范圍的蛋白總量對應50 ul BEADS?
答：50 ul beads對應的是一個(gè)reaction，而我們推薦一個(gè)reaction是100ul裂解上清（2×107 cells加入100ul RIP lysis buffer得到），所以只需要在裂解前計數一下，并按括號中的比例加入裂解buffer，后續100 ul 裂解上清就是一個(gè)reaction的蛋白用量。不建議通過(guò)裂解后測蛋白濃度的方法進(jìn)行配比。
10. RIP可以分提核漿的RNA-蛋白質(zhì)復合物嗎？
答：理論上，可以采用能分別抽提核漿蛋白的蛋白抽提kit先分離樣本，再進(jìn)行RIP實(shí)驗。但需要特別注意的是所用kit中的reagent不能有RNase和DNase，以及要能與下游的抗體beads孵育兼容。
