原位雜交（InSituHybridization）實(shí)驗要求及步驟
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發(fā)布時(shí)間：2016-11-03
原位雜交組織(或細胞)化學(xué) (In situ Hybridization Histochemistry，ISHH) 簡(jiǎn)稱(chēng)原位雜交(In Situ Hybridization)，屬于固相分子雜交的范疇，它是用標記的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織細胞內特定核酸序列的方法。根據所用探針和靶核酸的不同，原位雜交可分為DNA-DNA雜交，DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類(lèi)。根據探針的標記物是否直接被檢測，原位雜交又可分為直接法和間接法兩類(lèi)。直接法主要用放射性同位素、熒光及某些酶標記的探針與靶核酸進(jìn)行雜交，雜交后分別通過(guò)放射自顯影、熒光顯微鏡術(shù)或成色酶促反應直接顯示。間接法一般用半抗原標記探針，最后通過(guò)免疫組織化學(xué)法對半抗原定位，間接地顯示探針與靶核酸形成的雜交體。原位雜交最初是以同位素標記探針進(jìn)行的。盡管同位素標記(如35S，3H，32P等)仍然廣泛使用，但非同位素標記探針的迅速發(fā)展(尤其是生物素標記探針和地高辛標記探針)，更引起科技工作者的極大興趣。
一、基本要求
組織取材：組織取材應盡可能新鮮。由于組織RNA降解較快，所以新鮮組織和培養細胞最好在30min內固定。
固定目的是：
(1)保持細胞結構；
(2)最大限度地保持細胞內DNA或RNA的水平；
(3)使探針易于進(jìn)入細胞或組織。
最常用的固定劑是多聚甲醛，與其它醛類(lèi)固定劑(如戊二醛)不同，多聚甲醛不會(huì )與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，因而不會(huì )影響探針穿透入細胞或組織。
增強組織的通透性和核酸探針的穿透性：
(1)稀酸處理和酸酐處理：為防止探針與組織中堿性蛋白之間的靜電結合，以降低背景，雜交前標本可用0.25%乙酸酐處理10min，經(jīng)乙酸酐處理后，組織蛋白中的堿性基團通過(guò)乙?；蛔钄?。組織和細胞標本亦可用0.2M HCl處理10min，稀酸能使堿性蛋白變性，結合蛋白酶消化，容易將堿性蛋白移除。
(2)去污劑處理：去污劑處理的目的是增加組織的通透性，利于雜交探針進(jìn)入組織細胞，最常應用的去污劑是Triton X-100。注意：過(guò)度的去污劑處理不僅影響組織的形態(tài)結構，而且還會(huì )引起靶核酸的丟失。
(3) 蛋白酶處理：蛋白酶消化能使經(jīng)固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探針對靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K(proteinase K)，還有鏈霉蛋白酶(pronase)和胃蛋白酶(pepsin)等。
雜交緩沖液孵育：
雜交前用不含探針的雜交緩沖液在雜交溫度下孵育2hr，以阻斷玻片和標本中可能與探針產(chǎn)生非特異性結合的位點(diǎn)，達到減低背景的目的。
防止污染：
由于在手指皮膚及實(shí)驗室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實(shí)驗結果，在整個(gè)雜交前處理過(guò)程中都需要戴消毒手套，實(shí)驗所用玻璃器皿及鑷子都應于實(shí)驗前一日置高溫烘烤(180℃)以達到消除RNA酶的目的。雜交前及雜交時(shí)所用的溶液均需經(jīng)高壓消毒處理。
雙鏈DNA探針和靶DNA的變性：
雜交反應進(jìn)行時(shí)，探針和靶核酸都必須是單鏈的。如果用雙鏈DNA探針進(jìn)行雜交(包括檢測RNA時(shí))，雙鏈DNA探針在雜交前必須進(jìn)行變性。探針變性后要立即進(jìn)行雜交反應，不然解鏈的探針又會(huì )重新復性。
