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甲胎蛋白時(shí)間分辨熒光免疫分析

發(fā)布人：admin 瀏覽次數：1410 發(fā)布時(shí)間：2016-11-28


    近年發(fā)展的時(shí)間分辨熒光測量技術(shù)以稀土離子為示蹤材料，具有測量靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、示蹤物穩定、定量分析量程寬、無(wú)放射性污染和應用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。我們采用時(shí)間分辨熒光測量技術(shù)，建立了AFP時(shí)間分辨熒光免疫分析（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）。


　一、材料與方法

　 1. 材料與試劑：抗AFP單克隆抗體A137和A47由無(wú)錫市第二制藥廠(chǎng)提供。Eu3+標記盒、Eu3+發(fā)光增強液、AFP TRFIA藥盒和AFP參考標準，EG－G-Wallac產(chǎn)品。CA199、CA125和CA153參考標準，CIBACORNING產(chǎn)品。AFP質(zhì)量控制血清（L：21～35μg/L；M：62～93μg/L；H：173.4～260.2μg/L），中國藥品生物制品鑒定所產(chǎn)品。全自動(dòng)TRFIA檢測儀（Auto DELFIA 1235）為EG－G-Wallac產(chǎn)品。

　 2. 固相抗體制備：將A47單抗用50mmol/L Na2CO3-NaHCO3

　　pH9.6緩沖液稀釋至10mg/L的包被液,微孔板各孔加200μl，4℃放置過(guò)夜。BSA封閉后真空抽干，板條密封后置-20℃冷凍保存。


　 3. Eu3+-A137制備：參照Eu3+標記盒說(shuō)明書(shū)操作。取溶解于0.155mol/L

　 NaCl的50mmol/L Na2CO3-NaHCO3 pH8.5緩沖液A137（2g/L）500μl加入含0.2mg的Eu3+-N2-［p-異氰酸-芐基］-二乙烯三胺四乙酸（Eu3+-DTTA）凍干粉的小瓶中，30℃磁力攪拌反應20h。反應液經(jīng)用80mmol/L
　 Tris-HCl pH7.8緩沖液平衡的Sepharose CL-6B柱（1cm×40cm）層析，A280監測收集蛋白峰。

　 4. 測定方法：采用平衡法建立AFP-TRFIA，即在包被有A47的96孔微孔板上，每孔依次加入25μl AFP參考標準或待測血清，200μl以反應緩沖液1:1000稀釋的Eu3+-A137，25℃振蕩孵育1h后，用洗滌液洗滌6次。再加增強液200μl，25℃振蕩反應5min，熒光檢測。全部過(guò)程均在A(yíng)uto

　 DELFIA 1235上自動(dòng)完成，軟件設置由本所自編。

 　5. 數據分析和統計處理：AFP-TRFIA標準曲線(xiàn)由Auto DEFIA 1235自帶的Log-Logit函數處理。精密度圖和可測范圍分析用吳德福IRMA數據處理軟件。統計學(xué)處理用t 檢驗。


　二、結果

　 1.Eu3+-A137的理化和免疫學(xué)鑒定：Eu3+-A137以EG－G-Wallac提供的Eu3+標準為參考，平均每個(gè)A137 IgG上連接了7.52個(gè)Eu3+，產(chǎn)率達53.07%。選擇AFP參考標準高點(diǎn)（1000μg/L），Eu3+-A137 1:1000稀釋?zhuān)M(jìn)行TRFIA，Bmax/T為6.65%，與低點(diǎn)（1μg/L）的發(fā)光計數差達2個(gè)數量級以上。被測物和反應發(fā)光計數基本成算術(shù)級數正比關(guān)系。

　 2.AFP-TRFIA的考核：經(jīng)Log-Logit函數處理程序處理得AFP-TRFIA標準曲線(xiàn)。(1)方法的特異性：將CEA、CA199、CA125和CA153分別配成10～500U/ml、15.8～409U/ml、12.1～732U/ml和27.7～243U/ml一系列不同濃度，代替標準曲線(xiàn)中的AFP參考標準。在上述濃度范圍內，CEA、CA199、CA125和CA153對AFP-TRFIA均無(wú)交叉反應。(2)精密度和回收率：本方法的批內和批間CV分別為1.59%和7.14%，8批標準曲線(xiàn)的ABCV均小于0.0114，精密度圖顯示可測范圍為4.22～1210μg/L，回收率為103.98%。(3)靈敏度和穩定性：以零劑量點(diǎn)發(fā)光值均值加2s后的發(fā)光值在標準曲線(xiàn)上得到的相應值為0.43μg/L。8條不同時(shí)間進(jìn)行的AFP-TRFIA的效點(diǎn)均值ED20、ED50和ED80分別為（4.25±0.21)μg/L、（35.59±0.19)μg/L和（246.90±0.96)μg/L。


　三、討論

　 TRFIA測量?jì)x已進(jìn)入第三代，分析技術(shù)已實(shí)現高度自動(dòng)化。我們所建方法適于測量血清AFP的含量，Eu3+-A137經(jīng)標準曲線(xiàn)比較鑒定，免疫反應性基本無(wú)損失；其凍干品-30℃保存13個(gè)月后免疫反應參數基本未改變。用國家指定的AFP質(zhì)控血清作樣品進(jìn)行分析，L、M和H分別為28.0μg/L、77.5μg/L和216.8μg/L，符合質(zhì)控要求。我們曾把高含量的AFP血清樣品經(jīng)1:10～1000稀釋后用于本方法的測定，換算后的AFP含量非常接近；用該系列稀釋血清代替AFP參考標準作標準曲線(xiàn)，其斜率與AFP的標準曲線(xiàn)斜率基本一致，表明AFP-TRFIA有良好的健全性，血清基質(zhì)對本方法沒(méi)有明顯影響。8孔重復4組參考標準點(diǎn)的ABCV均＜0.06，批內及批間重復性研究亦證明本方法是可靠的。以往超微量免疫分析技術(shù)每次分析，即使單樣品檢測也必須做標準曲線(xiàn)作相對測量的依據。我們建立的AFP-TRFIA同批試劑連續5個(gè)月應用分析，發(fā)現標準曲線(xiàn)基本重合，無(wú)明顯漂移，可以用同批試劑單次標準曲線(xiàn)為今后分析的固定參考。這既可減輕臨床應用的工作強度，又可提高藥盒的經(jīng)濟價(jià)值。

　 AFP-TRFIA受檢血清用量?jì)H為RIA或IRMA的四分之一，有利于減少樣品對分析系統的干擾，也有助于節約樣品，便于多指標分析。AFP-TRFIA的分析時(shí)間僅為1h，且分析系統高度自動(dòng)化，這樣可提高臨床檢驗結果的速度，又可大幅度降低人為誤差和增加檢出結果的可靠性。


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